Компьютер томографиясе (КТ) ярдәмендә ачыкланган үпкә төеннәрен дифференциаль диагностикалау клиник практикада авыр булып кала. Монда без 480 кан сывороткасы үрнәгенең глобаль метаболомын характерлыйбыз, шул исәптән сәламәт контроль төркем, яман булмаган үпкә төеннәре һәм I стадиядәге үпкә аденокарциномасы. Аденокарциномалар уникаль метаболомик профильләргә ия, ә яман булмаган төеннәр һәм сәламәт кешеләр метаболомик профильләрдә югары охшашлыкка ия. Ачыш төркемендә (n = 306) яман булмаган һәм яман шеш төеннәрен аеру өчен 27 метаболит җыелмасы ачыкланды. Эчке валидация (n = 104) һәм тышкы валидация (n = 111) төркемнәрендә дискриминант моделенең AUC 0,915 һәм 0,945 тәшкил итте. Юл анализы үпкә аденокарциномасы кан сывороткасында триптофан кимүе белән бәйле гликолитик метаболитларның яман булмаган төеннәр һәм сәламәт контроль төркем белән чагыштырганда артуын күрсәтте һәм триптофанны үзләштерү үпкә яман шеше күзәнәкләрендә гликолизны стимуллаштыра дип фаразлый. Безнең тикшеренү КТ ярдәмендә ачыкланган үпкә төеннәре куркынычын бәяләүдә сыворотка метаболитлары биомаркерларының әһәмиятен күрсәтә.
Рак белән авыручыларның исән калу күрсәткечләрен яхшырту өчен иртә диагноз кую бик мөһим. АКШның Милли Үпкә Рагы Скринингы Сынавы (NLST) һәм Европа NELSON тикшеренүе нәтиҗәләре күрсәткәнчә, түбән дозалы компьютер томографиясе (LDCT) белән скрининг югары куркыныч төркемнәрендә үпкә рагы үлемен сизелерлек киметә ала1,2,3. Үпкә рагын скрининглау өчен LDCT киң кулланылганнан бирле, симптомсыз үпкә төеннәренең очраклы рентгенологик табылу очраклары арта бара4. Үпкә төеннәре диаметры 3 см га кадәр булган фокаль тоныклык буларак билгеләнә5. Без яман шеш ихтималын бәяләүдә һәм LDCT вакытында очраклы рәвештә ачыкланган күп санлы үпкә төеннәре белән эш итүдә кыенлыклар белән очрашабыз. КТ чикләүләре еш күзәтү тикшерүләренә һәм ялган уңай нәтиҗәләргә китерергә мөмкин, бу кирәксез тыкшынуларга һәм артык дәвалауга китерә6. Шуңа күрә, үпкә рагын башлангыч стадияләрдә дөрес билгеләү һәм башлангыч ачыклауда күпчелек яман булмаган төеннәрне аеру өчен ышанычлы һәм файдалы биомаркерлар эшләү зарур7.
Канның (сыворотка, плазма, периферик канның мононуклеар күзәнәкләре) комплекслы молекуляр анализы, шул исәптән геномика, протеомика яки ДНК метилизациясе8,9,10, үпкә яман шешен диагностикалау биомаркерларын ачуга кызыксыну артуга китерде. Шул ук вакытта, метаболомика ысуллары эндоген һәм экзоген йогынтылар йогынтысындагы күзәнәк продуктларын үлчи һәм шуңа күрә авыруның башлануын һәм нәтиҗәсен фаразлау өчен кулланыла. Сыек хроматография-тандем масса-спектрометриясе (LC-MS) югары сизгерлеге һәм зур динамик диапазоны аркасында метаболомика тикшеренүләре өчен киң кулланыла торган ысул булып тора, ул төрле физик-химик үзлекләргә ия метаболитларны үз эченә ала11,12,13. Плазма/сыворотканың глобаль метаболомик анализы үпкә яман шешен диагностикалау14,15,16,17 һәм дәвалау нәтиҗәлелеге белән бәйле биомаркерларны ачыклау өчен кулланылса да,18 яман шеш һәм яман шеш төеннәрен аеру өчен сыворотка метаболитлары классификаторлары әле дә күп өйрәнелергә тиеш. - зур тикшеренүләр.
Аденокарцинома һәм яссы күзәнәкле карцинома - кечкенә күзәнәкле булмаган үпкә яман шешенең (NSCLC) ике төп төре. Төрле компьютер томографиясе скрининг тестлары аденокарциноманың үпкә яман шешенең иң еш очрый торган гистологик төре булуын күрсәтә1,19,20,21. Бу тикшеренүдә без барлыгы 695 кан сывороткасы үрнәгендә, шул исәптән сәламәт контроль төркемендә, зарарсыз үпкә төеннәрендә һәм компьютер томографиясе белән ачыкланган ≤3 см сывороткада метаболомика анализын үткәрү өчен ультра-эффектив сыек хроматография-югары сыйфатлы масса-спектрометрия (UPLC-HRMS) кулландык. I стадиядәге үпкә аденокарциномасын скрининглау. Без үпкә аденокарциномасын зарарсыз төеннәрдән һәм сәламәт контроль төркемнәрдән аера торган кан сывороткасы метаболитлары панелен ачыкладык. Юлны баету анализы триптофан һәм глюкоза метаболизмының аномаль булуының зарарсыз төеннәр һәм сәламәт контроль төркемнәр белән чагыштырганда еш очрый торган үзгәрешләр булуын күрсәтте. Ниһаять, без LDCT ярдәмендә ачыкланган яман шеш һәм яман шеш төеннәрен аеру өчен югары спецификалы һәм сизгерлеккә ия булган сыворотка метаболик классификаторын булдырдык һәм валидацияләдек, бу иртә дифференциаль диагностика һәм куркынычларны бәяләүгә ярдәм итә ала.
Агымдагы тикшеренүдә җенес һәм яшь буенча туры килгән кан сарысуы үрнәкләре ретроспектив рәвештә 174 сәламәт контроль төркемнән, үпкәдәге яман шешле 292 пациенттан һәм үпкә аденокарциномасының I стадиясендәге 229 пациенттан җыелды. 695 кешенең демографик характеристикасы 1 нче өстәмә таблицада күрсәтелгән.
1a рәсемдә күрсәтелгәнчә, Сунь Ятсен университетының Онкология үзәгендә барлыгы 480 кан сывороткасы үрнәге, шул исәптән 174 сәламәт контроль (HC), 170 яман булмаган төен (BN) һәм 136 I стадиядәге үпкә аденокарциномасы (LA) үрнәкләре җыелган. Ультрафиолетлы сыек хроматография-югары сыйфатлы масса-спектрометрия (UPLC-HRMS) кулланып, максатчан булмаган метаболомик профильләү өчен ачыклау когортасы. 1 нче өстәмә рәсемдә күрсәтелгәнчә, классификация моделен булдыру һәм дифференциаль юл анализын алга таба өйрәнү өчен LA һәм HC, LA һәм BN арасындагы дифференциаль метаболитлар ачыкланган. Сунь Ятсен университетының Онкология үзәге тарафыннан җыелган 104 үрнәк һәм башка ике хастаханә тарафыннан җыелган 111 үрнәк эчке һәм тышкы валидациягә дучар ителгән.
a Ачыш когортасындагы тикшеренү популяциясе, ул ультра-эффектив сыек хроматография-югары ачыклыклы масса-спектрометрия (UPLC-HRMS) кулланып, глобаль сыворотка метаболомикасы анализын үткәрде. b Сәламәт контроль төркем (HC, n = 174), яман булмаган төеннәр (BN, n = 170) һәм I стадиядәге үпкә аденокарциномасы (Лос-Анджелес, n = 136) кертеп, тикшеренү когортасыннан алынган 480 сыворотка үрнәгенең гомуми метаболомының өлешчә иң кечкенә квадратлар дискриминант анализы (PLS-DA). +ESI, уңай электроспрей ионизациясе режимы, -ESI, тискәре электроспрей ионизациясе режимы. c–e Ике бирелгән төркемдә күплеге сизелерлек аерылып торган метаболитлар (ике койрыклы Уилкоксон имзасы белән билгеләнгән ранг тесты, ялган ачу тизлеге көйләнгән p кыйммәте, FDR <0.05) кызыл (бөкләү үзгәреше > 1.2) һәм зәңгәр (бөкләү үзгәреше < 0.83). ) вулкан графикасында күрсәтелгән. f LA һәм BN арасындагы аннотацияләнгән метаболитлар санындагы әһәмиятле аермаларны күрсәтүче иерархик кластерлаштыру җылылык картасы. Чыганак мәгълүматлары чыганак мәгълүмат файллары рәвешендә бирелә.
Ачыш төркемендәге 174 HC, 170 BN һәм 136 LA гомуми сыворотка метаболомы UPLC-HRMS анализы ярдәмендә анализланды. Башта без сыйфат контроле (QC) үрнәкләренең күзәтелмәгән төп компонент анализы (PCA) моделенең үзәгендә тыгыз урнашканлыгын күрсәтәбез, бу хәзерге тикшеренү нәтиҗәләренең тотрыклылыгын раслый (Өстәмә 2 нче рәсем).
1b рәсемендәге өлешчә иң кечкенә квадратлар дискриминант анализында (PLS-DA) күрсәтелгәнчә, без уңай (+ESI) һәм тискәре (−ESI) электроспрей ионлашу режимнарында LA һәм BN, LA һәм HC арасында ачык аермалар булуын ачыкладык. Шулай да, +ESI һәм -ESI шартларында BN һәм HC арасында әһәмиятле аермалар табылмады.
Без LA һәм HC арасында 382 дифференциаль үзенчәлек, LA һәм BN арасында 231 дифференциаль үзенчәлек һәм BN һәм HC арасында 95 дифференциаль үзенчәлек таптык (Wilcoxon имзалы ранг тесты, FDR <0.05 һәм күп үзгәреш >1.2 яки <0.83) (.1c-e рәсем). . Пиклар мәгълүмат базасына (mzCloud/HMDB/Chemspider китапханәсе) карата m/z кыйммәте, саклау вакыты һәм фрагментация масса спектрын эзләү (методлар бүлегендә җентекле мәгълүматлар тасвирланган) буенча аннотацияләнде (Өстәмә мәгълүмат 3). Ниһаять, LA vs BN (1f рәсем һәм 2 өстәмә таблица) һәм LA vs HC (3 өстәмә рәсем һәм 2 өстәмә таблица) өчен муллыкта әһәмиятле аермалары булган 33 һәм 38 аннотацияләнгән метаболит билгеләнде. Киресенчә, BN һәм HCда муллыкта әһәмиятле аермалары булган 3 метаболит кына билгеләнде (2 өстәмә таблица), бу PLS-DA да BN һәм HC арасындагы кабатлануга туры килә. Бу дифференциаль метаболитлар биохимик матдәләрнең киң диапазонын үз эченә ала (Өстәмә 4 нче рәсем). Бергәләп караганда, бу нәтиҗәләр сыворотка метаболомасында мөһим үзгәрешләрне күрсәтә, алар үпкә яман шешенең башлангыч стадиясендәге яман шеш трансформациясен чагылдыра, яман шешле үпкә төеннәре яки сәламәт кешеләр белән чагыштырганда. Шул ук вакытта, BN һәм HC сыворотка метаболомының охшашлыгы яман шешле үпкә төеннәренең сәламәт кешеләр белән күп биологик үзенчәлекләргә ия булуын күрсәтә. Эпидермаль үсеш факторы рецепторы (EGFR) ген мутацияләре үпкә аденокарциномасы 23 нче төрендә еш очрый икәнен исәпкә алып, без драйвер мутацияләренең сыворотка метаболомына йогынтысын билгеләргә тырыштык. Аннары без үпкә аденокарциномасы төркемендә EGFR статусы булган 72 очракның гомуми метаболомик профилен анализладык. Кызыклысы шунда ки, без PCA анализында EGFR мутант пациентлары (n = 41) һәм EGFR кыргый тип пациентлары (n = 31) арасында охшаш профильләр таптык (Өстәмә 5a рәсем). Шулай да, без EGFR мутациясе булган пациентларда кыргый типтагы EGFR белән чагыштырганда күплеге сизелерлек үзгәргән 7 метаболит ачыкладык (t-тест, p < 0,05 һәм бөкләнеш үзгәреше > 1,2 яки < 0,83) (Өстәмә 5b рәсем). Бу метаболитларның күпчелеге (7 дән 5) - ацилкарнитиннар, алар май кислоталарының оксидлашу юлларында мөһим роль уйныйлар.
2 нче рәсемнең а өлешендә күрсәтелгән эш процессында күрсәтелгәнчә, төеннәрне классификацияләү өчен биомаркерлар иң аз абсолют кыскару операторлары һәм LA (n = 136) һәм BN (n = 170) да ачыкланган 33 дифференциаль метаболит нигезендә сайлау ярдәмендә алынган. Үзгәрүчәннәрнең иң яхшы комбинациясе (LASSO) – икеле логистик регрессия моделе. Модельнең ышанычлылыгын тикшерү өчен ун тапкыр кросс-валидация кулланылды. Үзгәрүчәннәрне сайлау һәм параметрларны регуляризацияләү λ24 параметры белән ихтималлыкны максимальләштерү штрафы белән көйләнә. Дискриминант моделенең классификация эшчәнлеген тикшерү өчен глобаль метаболомика анализы эчке валидация (n = 104) һәм тышкы валидация (n = 111) төркемнәрендә мөстәкыйль рәвештә башкарылды. Нәтиҗәдә, ачышлар җыелмасындагы 27 метаболит иң зур уртача AUC кыйммәтенә ия булган иң яхшы дискриминант модель буларак билгеләнде (2б рәсем), шуларның 9ында BN белән чагыштырганда LAда активлык артты һәм 18ендә активлык кимрәк булды (2в рәсем).
Үпкә төеннәре классификаторын төзү өчен эш процессы, шул исәптән ун тапкыр кросс-валидация аша икелекле логистик регрессия моделен кулланып, ачышлар җыелмасында иң яхшы сыворотка метаболитлары панелен сайлау һәм эчке һәм тышкы валидация җыелмаларында фаразлау эшчәнлеген бәяләү. b Метаболик биомаркер сайлау өчен LASSO регрессия моделенең кросс-валидация статистикасы. Югарыда бирелгән саннар бирелгән λ да сайланган биомаркерларның уртача санын күрсәтә. Кызыл нокталы сызык тиешле лямбдадагы уртача AUC кыйммәтен күрсәтә. Соры хата полосалары минималь һәм максималь AUC кыйммәтләрен күрсәтә. Нокталы сызык 27 сайланган биомаркер белән иң яхшы модельне күрсәтә. AUC, кабул итүченең эш характеристикасы (ROC) кәкре астындагы мәйдан. c LA төркемендәге 27 сайланган метаболитның ачышлар төркемендәге BN төркеме белән чагыштырганда бөкләнү үзгәрешләре. Кызыл багана - активлаштыру. Зәңгәр багана - кимү. d–f Ачыклау, эчке һәм тышкы валидация җыелмаларындагы 27 метаболит комбинациясенә нигезләнгән дискриминант модельнең көчен күрсәтүче кабул итүченең эш характеристикасы (ROC) кәкреләре. Чыганак мәгълүматлары чыганак мәгълүмат файллары рәвешендә бирелә.
Бу 27 метаболитның авырлыклы регрессия коэффициентларына нигезләнеп фаразлау моделе төзелде (Өстәмә 3 нче таблица). Бу 27 метаболит нигезендә ROC анализы 0,933 кәкре астындагы мәйдан (AUC) кыйммәтен, ачу төркеменең сизгерлеге 0,868 һәм спецификлыгы 0,859 булуын күрсәтте (2d рәсем). Шул ук вакытта, LA һәм HC арасындагы 38 аннотацияләнгән дифференциаль метаболит арасында 16 метаболиттан торган җыелма LA һәм HC аеруда 0,902 AUCка иреште, сизгерлеге 0,801 һәм спецификлыгы 0,856 иде (Өстәмә 6a-c рәсем). Дифференциаль метаболитлар өчен төрле бөкләнеш үзгәрү чикләренә нигезләнгән AUC кыйммәтләре дә чагыштырылды. Без классификация моделенең бөкләнеш үзгәрү дәрәҗәсе 1,2 урынына 1,5 яки 2,0 булганда LA һәм BN (HC) арасында аерма ясауда иң яхшы нәтиҗә бирүен ачыкладык (Өстәмә 7a,b рәсемнәр). 27 метаболит төркеменә нигезләнгән классификация моделе эчке һәм тышкы когорталарда расланды. Эчке валидация өчен AUC 0,915 (сизгерлек 0,867, спецификлык 0,811) һәм тышкы валидация өчен 0,945 (сизгерлек 0,810, спецификлык 0,979) тәшкил итте (2e, f рәсемнәр). Лабораторияара нәтиҗәлелекне бәяләү өчен, тышкы когортадан 40 үрнәк "Методлар" бүлегендә тасвирланганча тышкы лабораториядә анализланды. Классификация төгәллеге AUC 0,925кә җитте (Өстәмә 8 нче рәсем). Үпкәнең яссы күзәнәкле карциномасы (LUSC) үпкә аденокарциномасыннан (LUAD) соң вак күзәнәкле булмаган үпкә яман шешенең (NSCLC) икенче иң еш очрый торган төре булганлыктан, без шулай ук метаболик профильләрнең расланган потенциаль файдалылыгын тикшердек. BN һәм LUSCның 16 очрагы. LUSC һәм BN арасындагы аерманың AUC күрсәткече 0,776 тәшкил итте (Өстәмә 9 нчы рәсем), бу LUAD һәм BN арасындагы аермага караганда сәләтнең начаррак булуын күрсәтә.
Тикшеренүләр күрсәткәнчә, компьютер томографиясендәге төеннәрнең зурлыгы яман шеш ихтималы белән уңай корреляциядә һәм төеннәрне дәвалауның төп билгеләүче факторы булып кала25,26,27. NELSON скрининг тикшеренүенең зур когортасыннан алынган мәгълүматларны анализлау күрсәткәнчә, төеннәре <5 мм булган кешеләрдә яман шеш куркынычы хәтта төеннәре булмаган кешеләрдәгегә дә охшаш28. Шуңа күрә, даими компьютер томографиясен күзәтүне таләп итә торган минималь зурлык Британия күкрәк җәмгыяте (BTS) тәкъдим иткәнчә 5 мм, ә Флейшнер җәмгыяте тәкъдим иткәнчә 6 мм29. Ләкин, 6 мм дан зуррак һәм ачык яман булмаган билгеләре булмаган, билгесез үпкә төеннәре (IPN) дип аталган төеннәр клиник практикада бәяләү һәм дәвалауда зур кыенлык булып кала30,31. Аннары без төен зурлыгының метаболомик имзаларга тәэсир итү-итмәвен ачыклау һәм эчке валидация когорталарыннан җыелган үрнәкләр ярдәмендә тикшердек. 27 валидацияләнгән биомаркерга игътибар итеп, без башта HC һәм BN суб-6 мм метаболомнарының PCA профильләрен чагыштырдык. Без HC һәм BN өчен күпчелек мәгълүмат нокталарының бер-берсенә туры килүен ачыкладык, бу ике төркемдә дә кан сарысуындагы метаболит дәрәҗәләренең охшаш булуын күрсәтә (3a рәсем). Төрле зурлык диапазоннарындагы үзенчәлекләр карталары BN һәм LA да сакланып калган (3b рәсем, c), ә яман шешле һәм яман шешле төеннәр арасында аерма 6–20 мм диапазонында күзәтелгән (3d рәсем). Бу когортаның AUC 0,927, спецификасы 0,868 һәм 6-20 мм зурлыктагы төеннәрнең яман шешлелеген фаразлау өчен сизгерлеге 0,820 булган (3e рәсем, f). Безнең нәтиҗәләр күрсәткәнчә, классификатор төен зурлыгына карамастан, иртә яман шеш трансформациясе аркасында килеп чыккан метаболик үзгәрешләрне теркәп бара ала.
ad 27 метаболиттан торган метаболик классификатор нигезендә билгеләнгән төркемнәр арасындагы PCA профильләрен чагыштыру. CC һәм BN < 6 мм. b BN < 6 мм vs BN 6–20 мм. LA 6–20 ммда LA 20–30 ммга каршы. g BN 6–20 мм һәм LA 6–20 мм. GC, n = 174; BN < 6 мм, n = 153; BN 6–20 мм, n = 91; LA 6–20 мм, n = 89; LA 20–30 мм, n = 77. e 6–20 мм төеннәр өчен дискриминант модель эшчәнлеген күрсәтүче кабул итүченең эш характеристикасы (ROC) кәкресе. f Ихтималлык кыйммәтләре 6–20 мм зурлыктагы төеннәр өчен логистик регрессия моделенә нигезләнеп исәпләнгән. Соры нокталы сызык оптималь чикләү кыйммәтен күрсәтә (0,455). Югарыдагы саннар Лос-Анджелес өчен фаразланган очракларның процентын күрсәтә. Ике яклы Стьюдент t тестын кулланыгыз. PCA, төп компонент анализы. Кыска астындагы AUC мәйданы. Чыганак мәгълүматлары чыганак мәгълүмат файллары рәвешендә бирелә.
Тәкъдим ителгән яман шешне фаразлау моделенең нәтиҗәлелеген күрсәтү өчен, охшаш зурлыктагы (7–9 мм) үпкә төеннәре белән дүрт үрнәк (44–61 яшьлек) сайлап алынды (4a, b рәсемнәр). Башлангыч скрининг вакытында 1 нче очрак кальцификацияле каты төен буларак күрсәтелде, бу үзенчәлек яман шеш белән бәйле, ә 2 нче очрак ачык яман шеш билгеләре булмаган билгесез өлешчә каты төен буларак күрсәтелде. Өч тапкыр күзәтү компьютер томографиясе бу очракларның 4 ел дәвамында тотрыклы булып калуын һәм шуңа күрә яман шеш төеннәре дип саналуын күрсәтте (4a рәсем). Серияле компьютер томографиясенең клиник бәяләве белән чагыштырганда, хәзерге классификатор моделе белән бер тапкыр үткәрелгән кан сарысуы метаболитларын анализлау бу яман шеш төеннәрен ихтималлык чикләүләренә нигезләнеп тиз һәм дөрес билгеләде (1 нче таблица). 3 нче очрактагы 4b рәсемдә плевра ретракциясе билгеләре булган төен күрсәтелгән, ул еш кына яман шеш белән бәйле32. 4 нче очрак яман шеш сәбәбен күрсәтүче билгесез өлешчә каты төен буларак күрсәтелде. Бу очракларның барысы да классификатор моделенә ярашлы яман шеш дип фаразланган (1 нче таблица). Үпкә аденокарциномасын бәяләү үпкә резекциясе операциясеннән соң гистопатологик тикшерү ярдәмендә күрсәтелгән (4б рәсем). Тышкы валидация җыелмасы өчен метаболик классификатор 6 мм дан зуррак билгесез үпкә төеннәренең ике очрагын төгәл фаразлаган (Өстәмә 10 нчы рәсем).
Ике яман шеш авыруының үпкәләренең аксиаль тәрәзәсенең компьютер томографиясе рәсемнәре. 1 нче очракта, 4 елдан соң компьютер томографиясе уң аскы бүлемдә кальцификация белән 7 мм зурлыктагы тотрыклы каты төенне күрсәтте. 2 нче очракта, 5 елдан соң компьютер томографиясе уң өске бүлемдә диаметры 7 мм булган тотрыклы, өлешчә каты төенне күрсәтте. b Үпкәләрнең аксиаль тәрәзә компьютер томографиясе рәсемнәре һәм үпкә резекциясе алдыннан I стадиядәге аденокарциноманың ике очрагының патологик тикшеренүләре. 3 нче очракта уң өске бүлемдә плевра ретракциясе белән диаметры 8 мм булган төен ачыкланды. 4 нче очракта сул өске бүлемдә 9 мм зурлыктагы өлешчә каты җир пыяла төене ачыкланды. Резекцияләнгән үпкә тукымасын гематоксилин һәм эозин (H&E) буявы (масштаблы сызык = 50 мкм) үпкә аденокарциномасының ацинар үсеш схемасын күрсәтә. Уклар компьютер томографиясе рәсемнәрендә табылган төеннәрне күрсәтә. H&E рәсемнәре - патологоанатом тарафыннан тикшерелгән берничә (>3) микроскопик кырның репрезентатив рәсемнәре.
Гомумән алганда, безнең нәтиҗәләр үпкә төеннәрен дифференциаль диагностикалауда сыворотка метаболиты биомаркерларының потенциаль кыйммәтен күрсәтә, бу исә КТ скринингын бәяләгәндә кыенлыклар тудырырга мөмкин.
Расланган дифференциаль метаболит панеленә нигезләнеп, без төп метаболик үзгәрешләрнең биологик корреляцияләрен ачыкларга тырыштык. MetaboAnalyst тарафыннан KEGG юлын баету анализы ике бирелгән төркем арасында 6 уртак, сизелерлек үзгәргән юлны ачыклады (LA vs. HC һәм LA vs. BN, көйләнгән p ≤ 0,001, эффект > 0,01). Бу үзгәрешләр пируват метаболизмы, триптофан метаболизмы, ниацин һәм никотинамид метаболизмы, гликолиз, TCA циклы һәм пурин метаболизмы бозылулары белән характерланды (5a рәсем). Аннары без абсолют санлаштыру ярдәмендә төп үзгәрешләрне тикшерү өчен максатчан метаболомика үткәрдек. Оешмага кергән юллардагы уртак метаболитларны аутентик метаболит стандартларын кулланып, өч квадруполь масса-спектрометрия (QQQ) ярдәмендә билгеләү. Метаболомика тикшеренүе максатлы үрнәгенең демографик үзенчәлекләре 4 нче өстәмә таблицада күрсәтелгән. Безнең глобаль метаболомика нәтиҗәләренә туры китереп, санлы анализ гипоксантин һәм ксантин, пируват һәм лактатның LAда BN һәм HC белән чагыштырганда артуын раслады (5b рәсем, c, p <0,05). Ләкин, BN һәм HC арасында бу метаболитларда әһәмиятле аермалар табылмады.
LA төркемендәге BN һәм HC төркемнәре белән чагыштырганда сизелерлек аерылып торган метаболитларның KEGG юлын баету анализы. Ике яклы Глобаль тест кулланылды, һәм p кыйммәтләре Холм-Бонферрони ысулы ярдәмендә көйләнде (p ≤ 0,001 көйләнгән һәм эффект зурлыгы > 0,01). b–d Скрипка графиклары LC-MS/MS ярдәмендә билгеләнгән HC, BN һәм LA кан сарысуындагы гипоксантин, ксантин, лактат, пируват һәм триптофан дәрәҗәләрен күрсәтә (төркем саен n = 70). Ак һәм кара нокталы сызыклар медиана һәм квартильне күрсәтә. e LUAD-TCGA мәгълүматлар җыелмасында нормаль үпкә тукымасы белән (n = 59) чагыштырганда, үпкә аденокарциномасында SLC7A5 һәм QPRTның нормальләштерелгән Log2TPM (миллионга транскриптлар) мРНК экспрессиясен күрсәтә (n = 513). Ак рамка квартильара диапазонны, үзәктәге горизонталь кара сызык медиананы, ә рамкадан сузылган вертикаль кара сызык 95% ышаныч интервалын (ИИ) күрсәтә. f TCGA мәгълүматлар җыелмасында үпкә аденокарциномасында (n = 513) һәм нормаль үпкә тукымасында (n = 59) SLC7A5 һәм GAPDH экспрессиясенең Пирсон корреляция графигы. Соры өлкә 95% ИИ күрсәтә. r, Пирсон корреляция коэффициенты. g LC-MS/MS ярдәмендә билгеләнгән специфик булмаган shRNA контроле (NC) һәм shSLC7A5 (Sh1, Sh2) белән трансфекцияләнгән A549 күзәнәкләрендә нормальләштерелгән күзәнәк триптофан дәрәҗәләре. Һәр төркемдәге биш биологик бәйсез үрнәкнең статистик анализы тәкъдим ителә. h A549 күзәнәкләрендә (NC) һәм SLC7A5 нокдаун A549 күзәнәкләрендә (Sh1, Sh2) NADt күзәнәк дәрәҗәләре (гомуми NAD, шул исәптән NAD+ һәм NADH). Һәр төркемдәге өч биологик бәйсез үрнәкнең статистик анализы тәкъдим ителә. i SLC7A5 нокдаунына кадәр һәм аннан соң A549 күзәнәкләренең гликолитик активлыгы тышкы әчеләнү тизлеге (ECAR) белән үлчәнде (төркемдә n = 4 биологик яктан бәйсез үрнәк). 2-DG, 2-дезокси-D-глюкоза. (b–h) дәресендә ике яклы Стьюдент t-тест кулланылды. (g–i) дәресендә хата сызыклары уртача ± SD ны күрсәтә, һәр эксперимент өч тапкыр бәйсез рәвештә башкарылды һәм нәтиҗәләр охшаш булды. Чыганак мәгълүматлары чыганак мәгълүмат файллары рәвешендә бирелә.
LA төркемендә триптофан метаболизмының үзгәрүенең сизелерлек йогынтысын исәпкә алып, без шулай ук QQQ кулланып HC, BN һәм LA төркемнәрендә кан сарысуындагы триптофан дәрәҗәсен бәяләдек. Без LAда кан сарысуындагы триптофанның HC яки BN белән чагыштырганда кимегәнен ачыкладык (p < 0,001, 5d рәсем), бу үпкә яман шеше белән авыручыларда кан әйләнешендәге триптофан дәрәҗәсе контроль төркемдәге сәламәт контроль төркемгә караганда түбәнрәк булуы турындагы элеккеге ачышлар белән туры килә33,34,35. ПЭТ/КТ индикаторы 11C-метил-L-триптофанны кулланып башка бер тикшеренүдә үпкә яман шеше тукымасында триптофан сигналын саклау вакыты яман шешләргә яки нормаль тукымаларга караганда сизелерлек артуы ачыкланды36. Без LA кан сарысуындагы триптофан кимүе үпкә яман шеше күзәнәкләре тарафыннан актив триптофан сеңдерелүен чагылдырырга мөмкин дип фаразлыйбыз.
Шулай ук триптофан катаболизмының кинуренин юлының соңгы продукты NAD+37,38 булуы билгеле, ул глицеральдегид-3-фосфатның 1,3-бисфосфоглицерат белән гликолиз реакциясе өчен мөһим субстрат булып тора39. Элегрәк үткәрелгән тикшеренүләр триптофан катаболизмының иммун көйләүдәге роленә юнәлтелгән булса да, без хәзерге тикшеренүдә күзәтелгән триптофан дисрегуляциясе һәм гликолитик юллар арасындагы бәйләнешне ачыкларга тырыштык. Эретелгән матдәләрне ташучы 7 әгъза 5 гаиләсе (SLC7A5) триптофан ташучы буларак билгеле43,44,45. Хинолин кислотасы фосфорибозилтрансфераза (QPRT) - кинуренин юлының аскы агымында урнашкан, хинолин кислотасын NAMN46 га әйләндерә торган фермент. LUAD TCGA мәгълүматлар җыелмасын тикшерү SLC7A5 һәм QPRT икесенең дә шеш тукымаларында нормаль тукымаларга караганда сизелерлек югарырак регуляцияләнгәнен күрсәтте (5e рәсем). Бу арту үпкә аденокарциномасының I һәм II стадияләрендә, шулай ук III һәм IV стадияләрендә күзәтелде (Өстәмә 11 нче рәсем), бу шеш барлыкка килү белән бәйле триптофан метаболизмының иртә бозылуларын күрсәтә.
Моннан тыш, LUAD-TCGA мәгълүматлар җыелмасы яман шеш белән авыручылар үрнәкләрендә SLC7A5 һәм GAPDH мРНК экспрессиясе арасында уңай корреляция күрсәтте (r = 0.45, p = 1.55E-26, 5f рәсем). Киресенчә, нормаль үпкә тукымаларында мондый ген имзалары арасында әһәмиятле корреляция табылмады (r = 0.25, p = 0.06, 5f рәсем). A549 күзәнәкләрендә SLC7A5 (Өстәмә 12 нче рәсем) нокауны күзәнәк триптофан һәм NAD(H) дәрәҗәсен сизелерлек киметте (5g,h рәсем), нәтиҗәдә, күзәнәктән тыш кислоталашу тизлеге (ECAR) белән үлчәнгән гликолитик активлык кимүгә китерде (1 нче рәсем). 5i). Шулай итеп, кан сарысуындагы метаболик үзгәрешләргә һәм in vitro ачыклауга нигезләнеп, без триптофан метаболизмы кинуренин юлы аша NAD+ җитештерергә һәм үпкә яман шешендә гликолизны стимуллаштыруда мөһим роль уйнарга мөмкин дип фаразлыйбыз.
Тикшеренүләр күрсәткәнчә, LDCT ярдәмендә ачыкланган күп санлы билгесез үпкә төеннәре, яман шеш диагнозы ялган уңай нәтиҗә бирү сәбәпле, ПЭТ-КТ, үпкә биопсиясе һәм артык дәвалау кебек өстәмә тикшерүләр үткәрү зарурлыгына китерергә мөмкин.31 6 нчы рәсемдә күрсәтелгәнчә, безнең тикшеренү КТ ярдәмендә ачыкланган үпкә төеннәренең куркыныч стратификациясен һәм аннан соң дәвалануын яхшыртырга мөмкин булган потенциаль диагностик әһәмияткә ия булган сыворотка метаболитлары панелен ачыклады.
Үпкә төеннәре түбән дозалы компьютер томографиясе (ТКТ) ярдәмендә бәяләнә, анда яман шеш яки яман шеш сәбәпләрен күрсәтә торган визуализация үзенчәлекләре бар. Төеннәрнең билгесез нәтиҗәсе еш күзәтүләргә, кирәксез чараларга һәм артык дәвалауга китерергә мөмкин. Диагностик әһәмияткә ия булган сыворотка метаболик классификаторларын кертү үпкә төеннәренең куркынычын бәяләүне һәм аннан соң дәвалануын яхшыртырга мөмкин. ПЭТ позитрон-эмиссион томографиясе.
АКШ NLST тикшеренүе һәм Европа NELSON тикшеренүе мәгълүматлары югары куркыныч төркемнәрен түбән дозалы компьютер томографиясе (LDCT) белән тикшерү үпкә яман шешеннән үлем очракларын киметергә мөмкин дип күрсәтә1,3. Шулай да, LDCT ярдәмендә ачыкланган күп санлы очраклы үпкә төеннәрен куркынычны бәяләү һәм аннан соң клиник дәвалау иң катлаулы мәсьәлә булып кала. Төп максат - ышанычлы биомаркерларны кертү юлы белән LDCT нигезендәге гамәлдәге протоколларны дөрес классификацияләүне оптимальләштерү.
Кан метаболитлары кебек кайбер молекуляр биомаркерлар үпкә яман шешен сәламәт контроль төркем белән чагыштыру юлы белән ачыкланды15,17. Хәзерге тикшеренүдә без LDCT ярдәмендә очраклы рәвештә ачыкланган яман шешле һәм яман шешле үпкә төеннәрен аеру өчен сыворотка метаболомикасы анализын куллануга игътибар иттек. Без UPLC-HRMS анализын кулланып, сәламәт контроль (HC), яман шешле үпкә төеннәренең (BN) һәм I стадиядәге үпкә аденокарциномасы (LA) үрнәкләренең глобаль сыворотка метаболомын чагыштырдык. Без HC һәм BN метаболик профильләренең охшаш булуын, ә LA HC һәм BN белән чагыштырганда сизелерлек үзгәрешләр күрсәткәнен ачыкладык. Без LAны HC һәм BNнан аеручы ике сыворотка метаболитлары җыелмасын ачыкладык.
Хәзерге вакытта LDCT нигезендәге яман шеш һәм төеннәрне ачыклау схемасы, нигездә, төеннәрнең зурлыгына, тыгызлыгына, морфологиясенә һәм вакыт узу белән үсеш тизлегенә нигезләнгән30. Элегрәк үткәрелгән тикшеренүләр төеннәрнең зурлыгы үпкә яман шеше ихтималы белән тыгыз бәйләнгәнлеген күрсәтте. Хәтта югары куркынычлы пациентларда да, <6 мм төеннәрдә яман шеш куркынычы <1% тәшкил итә. 6-20 мм зурлыктагы төеннәр өчен яман шеш куркынычы 8% тан 64% ка кадәр30. Шуңа күрә Флейшнер җәмгыяте гадәти компьютер томографиясе өчен 6 мм кисү диаметрын тәкъдим итә.29 Ләкин, 6 мм дан зуррак билгесез үпкә төеннәренең (IPN) куркынычын бәяләү һәм дәвалау тиешенчә башкарылмаган31. Тумыштан килгән йөрәк авыруларын хәзерге вакытта дәвалау гадәттә игътибарлы көтүгә һәм еш компьютер томографиясен күзәтүгә нигезләнгән.
Расланган метаболомга нигезләнеп, без беренче тапкыр сәламәт кешеләр һәм 6 мм дан кимрәк яман шешләр арасындагы метаболомик билгеләрнең кабатлануын күрсәттек. Биологик охшашлык элеккеге КТ нәтиҗәләре белән туры килә, анда 6 мм дан кимрәк шешләр өчен яман шеш куркынычы төеннәре булмаган кешеләрдәге кебек үк түбән.30 Шунысын да билгеләп үтәргә кирәк, безнең нәтиҗәләр шулай ук 6 мм дан кимрәк һәм ≥6 мм зурлыктагы яман шешләр метаболомик профильләрдә югары охшашлыкка ия булуын күрсәтә, бу яман шеш этиологиясенең функциональ билгеләмәсе төен зурлыгына карамастан тотрыклы булуын күрсәтә. Шулай итеп, заманча диагностик сыворотка метаболит панельләре төеннәр башта КТда ачыкланганда бер анализны кире кагу тесты буларак тәкъдим итә ала һәм серияле мониторингны киметергә мөмкин. Шул ук вакытта, шул ук метаболик биомаркерлар панеле зурлыгы ≥6 мм булган яман шеш төеннәрен яман шешләрдән аерды һәм охшаш зурлыктагы IPN һәм КТ рәсемнәрендә аңлашылмаган морфологик үзенчәлекләр өчен төгәл фаразлар бирде. Бу сыворотка метаболизмы классификаторы ≥6 мм зурлыктагы шешләрнең яман шешен фаразлауда яхшы нәтиҗә бирде, AUC 0,927 иде. Гомумән алганда, безнең нәтиҗәләр күрсәткәнчә, кан сарысуындагы уникаль метаболомик билгеләрнең шеш китереп чыгарган метаболик үзгәрешләрне чагылдырырга һәм төеннәрнең зурлыгына бәйсез рәвештә куркыныч фаразлаучылар буларак потенциаль кыйммәткә ия булырга мөмкин.
Шунысы игътибарга лаек, үпкә аденокарциномасы (LUAD) һәм яссы күзәнәкле карцинома (LUSC) - кечкенә күзәнәкле булмаган үпкә яман шешенең (NSCLC) төп төрләре. LUSC тәмәке куллану белән нык бәйле булуын47 һәм LUAD компьютер томографиясендә ачыкланган очраклы үпкә төеннәренең иң еш очрый торган гистологиясе булуын48 исәпкә алып, безнең классификатор моделе I стадиядәге аденокарцинома үрнәкләре өчен махсус төзелгән. Ван һәм хезмәттәшләре шулай ук LUADка игътибар иттеләр һәм үпкә яман шешенең иртә стадиясен сәламәт кешеләрдән аеру өчен липидомика кулланып тугыз липид билгесен ачыкладылар17. Без хәзерге классификатор моделен I стадиядәге LUSCның 16 очрагында һәм 74 яман булмаган төендә сынап карадык һәм LUSC фаразлау төгәллегенең түбән булуын (AUC 0.776) күзәттек, бу LUAD һәм LUSCның үзләренең метаболомик билгеләре булырга мөмкин дигән фикерне күрсәтә. Чыннан да, LUAD һәм LUSC этиологиясе, биологик килеп чыгышы һәм генетик аберрацияләре буенча аерылып торуы күрсәтелгән49. Шуңа күрә, скрининг программаларында үпкә яман шешен халыкка нигезләнеп ачыклау өчен укыту модельләренә башка төр гистологияләр дә кертелергә тиеш.
Монда без сәламәт контроль һәм яман булмаган төеннәр белән чагыштырганда үпкә аденокарциномасында иң еш үзгәрә торган алты юлны билгеләдек. Ксантин һәм гипоксантин - пурин метаболизмы юлының еш очрый торган метаболитлары. Безнең нәтиҗәләргә туры китереп, үпкә аденокарциномасы белән авыручыларның кан сарысуында яки тукымаларында сәламәт контроль яки преинвазив стадиядәге пациентлар белән чагыштырганда пурин метаболизмы белән бәйле арадаш продуктлар сизелерлек арткан15,50. Кан сарысуында ксантин һәм гипоксантин дәрәҗәләренең югары булуы тиз үрчеүче яман шеш күзәнәкләре өчен кирәкле анаболизмны чагылдырырга мөмкин. Глюкоза метаболизмының бозылуы яман шеш метаболизмының билгеле билгесе51. Монда без HC һәм BN төркемнәре белән чагыштырганда LA төркемендә пируват һәм лактатның сизелерлек артуын күзәттек, бу кечкенә күзәнәкле булмаган үпкә яман шеше (NSCLC) пациентлары һәм сәламәт контроль төркеменең кан сарысу метаболомы профильләрендә гликолитик юл аномалияләре турындагы элеккеге хәбәрләргә туры килә. Нәтиҗәләр сизелерлек52,53.
Иң мөһиме, без үпкә аденокарциномалары кан сарысуында пируват һәм триптофан метаболизмы арасында кире корреляция күзәттек. LA төркемендә кан сарысуындагы триптофан дәрәҗәсе HC яки BN төркеменә караганда кимегән. Кызыклысы шунда ки, перспектив когорта кулланып үткәрелгән алдагы зур күләмле тикшеренүдә кан әйләнешендәге триптофанның түбән дәрәҗәсе үпкә яман шеше куркынычы арту белән бәйле булуы ачыкланган 54. Триптофан - без тулысынча ризыктан ала торган мөһим аминокислота. Без үпкә аденокарциномасында кан сарысуындагы триптофан кимүе бу метаболитның тиз кимүен чагылдырырга мөмкин дигән нәтиҗәгә киләбез. Кинуренин юлы аша триптофан катаболизмының соңгы продукты de novo NAD+ синтезы чыганагы булуы билгеле. NAD+ нигездә коткару юлы аша җитештерелгәнлектән, сәламәтлек һәм авыруларда триптофан метаболизмындагы NAD+ әһәмияте билгеләнергә тиеш46. TCGA мәгълүмат базасын анализлау күрсәткәнчә, триптофан ташучы эремә ташучы 7A5 (SLC7A5) экспрессиясе үпкә аденокарциномасында нормаль контроль төркем белән чагыштырганда сизелерлек арткан һәм гликолитик фермент GAPDH экспрессиясе белән уңай корреляциядә булган. Элегерәк үткәрелгән тикшеренүләр, нигездә, триптофан катаболизмының шешкә каршы иммун җавапны бастырудагы роленә юнәлтелгән иде40,41,42. Монда без үпкә яман шеше күзәнәкләрендә SLC7A5 нокдаун белән триптофанны үзләштерүне тоткарлау күзәнәк NAD дәрәҗәсенең кимүенә һәм шул ук вакытта гликолитик активлыкның кимүенә китерә икәнен күрсәтәбез. Кыскасы, безнең тикшеренү үпкә аденокарциномасының яман шеш трансформациясе белән бәйле сыворотка метаболизмындагы үзгәрешләр өчен биологик нигез бирә.
EGFR мутацияләре - NSCLC белән авыручыларда иң еш очрый торган драйвер мутацияләре. Безнең тикшеренүдә без EGFR мутациясе булган пациентларның (n = 41) гомуми метаболомик профильләре кыргый типтагы EGFR (n = 31) белән авыручыларныкына охшаш булуын ачыкладык, гәрчә ацилкарнитинлы пациентларда кайбер EGFR мутант пациентларының кан сарысуындагы дәрәҗәләре кимүен ачыкласак та. Ацилкарнитиннарның билгеләнгән функциясе - ацил төркемнәрен цитоплазмадан митохондриаль матрицага күчерү, бу май кислоталарының энергия җитештерү өчен оксидлашуына китерә 55. Безнең тикшеренүләр белән туры китереп, 102 үпкә аденокарциномасы тукымалары үрнәкләренең глобаль метаболомын анализлау юлы белән EGFR мутант һәм EGFR кыргый типтагы шешләр арасында охшаш метаболом профильләрен ачыклады50. Кызыклысы шунда ки, ацилкарнитин күләме EGFR мутант төркемендә дә табылган. Шуңа күрә, ацилкарнитин дәрәҗәсендәге үзгәрешләр EGFR китереп чыгарган метаболик үзгәрешләрне һәм аның нигезендәге молекуляр юлларны чагылдырамы, алга таба өйрәнү кирәк булырга мөмкин.
Йомгаклап әйткәндә, безнең тикшеренү үпкә төеннәрен дифференциаль диагностикалау өчен кан сарысуындагы метаболик классификаторны булдыра һәм компьютер томографиясе скринингы нигезендә куркынычларны бәяләүне оптимальләштерә һәм клиник дәвалауны җиңеләйтә ала торган эш процессын тәкъдим итә.
Бу тикшеренү Сунь Ятсен университеты онкология хастаханәсенең этика комитеты, Сунь Ятсен университетының беренче филиал хастаханәсе һәм Чжэнчжоу университеты онкология хастаханәсенең этика комитеты тарафыннан расланган. Ачу һәм эчке валидация төркемнәрендә, Сунь Ятсен университеты онкология үзәгенең яман шешне контрольдә тоту һәм профилактикалау бүлегендә ел саен медицина тикшерүе үтүче кешеләрдән сәламәт кешеләрдән 174 сыворотка һәм яман шеш төеннәреннән 244 сыворотка, һәм Сунь Ятсен университеты онкология үзәгеннән 166 яман шеш төеннәре җыелган. I стадиядәге үпкә аденокарциномалары Сунь Ятсен университеты онкология үзәгеннән җыелган. Тышкы валидация когортасында яман шеш төеннәренең 48 очрагы, Сунь Ятсен университетының беренче филиал хастаханәсеннән I стадиядәге үпкә аденокарциномасының 39 очрагы һәм Чжэнчжоу онкология хастаханәсеннән I стадиядәге үпкә аденокарциномасының 24 очрагы булган. Сунь Ятсен Университетының Онкология Үзәге шулай ук I стадиядәге яссы күзәнәкле үпкә яман шешенең 16 очрагын җыйды, билгеләнгән метаболик классификаторның диагностик сәләтен тикшерү өчен (пациентларның характеристикасы 5 нче өстәмә таблицада күрсәтелгән). Ачыклау когортасыннан һәм эчке валидация когортасыннан үрнәкләр 2018 елның гыйнварыннан 2020 елның маена кадәр җыелды. Тышкы валидация когортасы өчен үрнәкләр 2021 елның августыннан 2022 елның октябренә кадәр җыелды. Җенескә карата тигез булмаганлыкны минимальләштерү өчен, һәр когортага якынча тигез санда ир-ат һәм хатын-кыз очраклары билгеләнде. Ачыклау төркеме һәм эчке тикшерү төркеме. Катнашучының җенесе үз-үзенә отчет бирү нигезендә билгеләнде. Барлык катнашучылардан да хәбәрдар ризалык алынды һәм компенсация бирелмәде. Залалсыз төеннәре булган субъектлар - анализ вакытында 2-5 ел эчендә тотрыклы КТ скан баллы булган кешеләр, тышкы валидация үрнәгеннән 1 очрактан кала, ул операциягә кадәр җыелган һәм гистопатология ярдәмендә диагноз куелган. Хроник бронхиттан кала. Үпкә аденокарциномасы очраклары үпкә резекциясе алдыннан җыелды һәм патологик диагноз белән расланды. Ач карынга кан үрнәкләре сыворотканы аеру пробиркаларында антикоагулянтларсыз җыелды. Кан үрнәкләре бүлмә температурасында 1 сәгать дәвамында коагуляцияләнде, аннары сыворотка өслеген җыю өчен 2851 × g тизлегендә 4°C температурада 10 минут дәвамында центрифугаланды. Сыворотка аликвотлары -80°C температурада метаболитлар алынганчы туңдырылды. Сунь Ятсен университетының Онкология үзәгенең Онкологияне профилактикалау һәм медицина тикшерүе бүлеге 100 сәламәт донордан, шул исәптән 40 яшьтән 55 яшькә кадәрге ир-атлар һәм хатын-кызлардан, сыворотка пулын җыйды. Һәр донор үрнәгенең тигез күләмнәре кушылды, нәтиҗәдә алынган пул аликвотацияләнде һәм -80°C температурада сакланды. Сыворотка катнашмасы сыйфатны контрольдә тоту һәм мәгълүматларны стандартлаштыру өчен белешмә материал буларак кулланылды.
Референс сыворотка һәм сынау үрнәкләре эретелде һәм метаболитлар берләштерелгән экстракция ысулы (MTBE/метанол/су) ярдәмендә алынды 56. Кыскасы, 50 мкл сыворотка 225 мкл бозлы салкын метанол һәм 750 мкл бозлы салкын метилтерт-бутил эфиры (MTBE) белән кушылды. Катнашманы болгатыгыз һәм 1 сәгать бозда инкубацияләгез. Аннары үрнәкләр кушылды һәм Cambridge Isotope Laboratories компаниясеннән сатып алынган эчке стандартлар (13C-лактат, 13C3-пируват, 13C-метионин һәм 13C6-изолейцин) булган 188 мкл MS-дәрәҗәле су белән вортексланды. Аннары катнашма 15000 × g тизлектә 4°C температурада 10 минут центрифугаланды, ә аскы фаза уңай һәм тискәре режимнарда LC-MS анализы өчен ике пробиркага (һәрберсе 125 мкл) күчерелде. Ниһаять, үрнәк югары тизлекле вакуум концентраторында коры булганчы парга әйләндерелде.
Киптерелгән метаболитлар 120 мкл 80% ацетонитрилда эретелде, 5 минут дәвамында вортексланды һәм 4°C температурада 10 минут дәвамында 15000 × g тизлектә центрифугаланды. Супернатантлар метаболомика тикшеренүләре өчен микроөстәмәләр белән янтарь пыяла флаконнарга күчерелде. Ультрафиолетлы сыек хроматография-югары ачыклыклы масса-спектрометрия (UPLC-HRMS) платформасында максатчан булмаган метаболомика анализы. Метаболитлар Dionex Ultimate 3000 UPLC системасы һәм ACQUITY BEH амид колонкасы (2.1 × 100 мм, 1.7 мкм, Уотерс) ярдәмендә аерылды. Уңай ион режимында хәрәкәтчән фазалар 95% (A) һәм 50% ацетонитрил (B) иде, һәрберсендә 10 ммоль/л аммоний ацетаты һәм 0.1% кубыз кислотасы бар иде. Тискәре режимда, A һәм B хәрәкәтчән фазаларында 95% һәм 50% ацетонитрил бар иде, ике фазада да 10 ммоль/л аммоний ацетаты бар иде, pH = 9. Градиент программасы түбәндәгечә иде: 0–0,5 мин, 2% B; 0,5–12 мин, 2–50% B; 12–14 мин, 50–98% B; 14–16 мин, 98% B; 16–16,1 мин, 98–2% B; 16,1–20 мин, 2% B. Автосамплерда колонна 40°C температурада, ә үрнәк 10°C температурада тотылды. Агым тизлеге 0,3 мл/мин, инъекция күләме 3 мкл иде. Электропропрей ионизациясе (ESI) чыганагы булган Q-Exactive Orbitrap масса-спектрометры (Thermo Fisher Scientific) тулы сканерлау режимында эшләде һәм зур күләмдәге мәгълүмат җыю өчен ddMS2 мониторинг режимы белән берләштерелде. MS параметрлары түбәндәгечә билгеләнде: сиптерү көчәнеше +3,8 кВ/- 3,2 кВ, капилляр температурасы 320°C, саклагыч газ 40 арб, ярдәмче газ 10 арб, зонд җылыткыч температурасы 350°C, сканерлау диапазоны 70–1050 м/сәг, чишелеш 70 000. Мәгълүматлар Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific) ярдәмендә алынды.
Мәгълүматлар сыйфатын бәяләү өчен, һәр үрнәктән 10 мкл өслек катламын алып, берләштерелгән сыйфат контроле (QC) үрнәкләре алынды. UPLC-MS системасының тотрыклылыгын бәяләү өчен аналитик эзлеклелек башында алты сыйфат контроле үрнәге инъекциясе анализланды. Аннары сыйфат контроле үрнәкләре партиягә вакыт-вакыт кертелә. Бу тикшеренүдә сыворотка үрнәкләренең барлык 11 партиясе дә LC-MS ярдәмендә анализланды. 100 сәламәт донордан алынган сыворотка пулы катнашмасының аликвотлары экстракция процессын күзәтү һәм партиядән партиягә йогынтыны көйләү өчен тиешле партияләрдә белешмә материал буларак кулланылды. Сунь Ятсен университетының Метаболомика үзәгендә ачыклау когортасының, эчке валидация когортасының һәм тышкы валидация когортасының максатчан булмаган метаболомика анализы үткәрелде. Гуандун технология университетының анализ һәм сынау үзәгенең тышкы лабораториясе шулай ук классификатор моделенең эшчәнлеген тикшерү өчен тышкы когортадан 40 үрнәкне анализлады.
Экстракциядән һәм яңадан торгызылганнан соң, кан сарысуындагы метаболитларның абсолют саны күп реакция мониторингы (MRM) режимында электроспрей ионизациясе (ESI) чыганагы белән ультра югары нәтиҗәле сыек хроматография-тандем масса-спектрометриясе (Agilent 6495 өчле квадруполь) ярдәмендә үлчәнде. Метаболитларны аеру өчен ACQUITY BEH амид колонкасы (2.1 × 100 мм, 1.7 мкм, Уотерс) кулланылды. Күчмә фаза 90% (A) һәм 10 ммоль/л аммоний ацетаты һәм 0.1% аммиак эремәсе белән 5% ацетонитрилдан (B) торды. Градиент программасы түбәндәгечә иде: 0–1.5 мин, 0% B; 1.5–6.5 мин, 0–15% B; 6.5–8 мин, 15% B; 8–8.5 мин, 15%–0% B; 8.5–11.5 мин, 0%B. Автосамплерда колонка 40 °C, ә үрнәк 10 °C температурада тотылды. Агым тизлеге 0,3 мл/мин, ә инъекция күләме 1 мкл иде. MS параметрлары түбәндәгечә билгеләнде: капилляр көчәнеш ±3,5 кВ, небулайзер басымы 35 psi, тышча газы агымы 12 л/мин, тышча газы температурасы 350 °C, киптерү газы температурасы 250 °C һәм киптерү газы агымы 14 л/мин. Триптофан, пируват, лактат, гипоксантин һәм ксантинның MRM конверсияләре 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 һәм 151,0–107,9 тәшкил итте. Мәгълүматлар Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies) ярдәмендә җыелды. Кан сывороткасы үрнәкләре өчен триптофан, пируват, лактат, гипоксантин һәм ксантин стандарт катнашма эремәләренең калибрлау кәкреләре ярдәмендә санлаштырылды. Күзәнәк үрнәкләре өчен триптофан күләме эчке стандартка һәм күзәнәк аксымы массасына нормальләштерелде.
Пик экстракциясе (м/з һәм саклау вакыты (RT)) Compound Discovery 3.1 һәм TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific) ярдәмендә башкарылды. Партияләр арасындагы потенциал аермаларны бетерү өчен, сынау үрнәгенең һәр характерлы пигы чагыштырмача күплекне алу өчен шул ук партиядән алынган эталон материалның характерлы пигына бүленде. Стандартлаштыру алдыннан һәм аннан соң эчке стандартларның чагыштырма стандарт тайпылышлары 6 нчы өстәмә таблицада күрсәтелгән. Ике төркем арасындагы аермалар ялган ачу тизлеге (FDR<0.05, Wilcoxon имзалы ранг тесты) һәм бөкләнү үзгәреше (>1.2 яки <0.83) белән характерланды. Алынган үзенчәлекләрнең чимал MS мәгълүматлары һәм эталон сыворотка белән төзәтелгән MS мәгълүматлары 1 нче өстәмә мәгълүматта һәм 2 нче өстәмә мәгълүматта күрсәтелгән. Пик аннотациясе билгеләнгән дүрт идентификация дәрәҗәсенә нигезләнеп башкарылды, шул исәптән ачыкланган метаболитлар, фаразланган аннотацияләнгән кушылмалар, фаразланган характерланган кушылма класслары һәм билгесез кушылмалар 22. Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider) мәгълүмат базасында эзләүләр нигезендә, дифференциаль метаболом арасында арадашчы буларак MS/MS туры килгән яки mzCloud (балл > 85) яки Chemspider'да төгәл туры килгән аннотацияләре булган биологик кушылмалар сайланды. Һәр үзенчәлек өчен иң югары аннотацияләр Өстәмә мәгълүматлар 3'тә кертелгән. MetaboAnalyst 5.0 сумма нормальләштерелгән метаболитлар күплегенең бер үзгәрүчәнле анализы өчен кулланылды. MetaboAnalyst 5.0 шулай ук KEGG юлын баету анализын шактый төрле метаболитлар нигезендә бәяләде. Төп компонент анализы (PCA) һәм өлешчә иң кечкенә квадратлар дискриминант анализы (PLS-DA) ropls программа пакеты (v.1.26.4) ярдәмендә стек нормальләштерү һәм автомасштаблау белән анализланды. Төен яман шешен фаразлау өчен оптималь метаболит биомаркер моделе иң кечкенә абсолют кыскару һәм сайлау операторы белән бинар логистик регрессия ярдәмендә булдырылды (LASSO, R пакеты v.4.1-3). Дискриминант моделенең ачыклау һәм валидация җыелмаларындагы эшчәнлеге pROC пакетына (v.1.18.0.) туры китереп, ROC анализы нигезендә AUC бәяләү юлы белән характерланды. Оптималь ихтималлык чиге модельнең максималь Юден индексы нигезендә алынды (сизгерлек + спецификлык – 1). Бушлыктан кимрәк яки зуррак кыйммәтләргә ия булган үрнәкләр, тиешенчә, зарарсыз төеннәр һәм үпкә аденокарциномасы буларак фаразланачак.
A549 күзәнәкләре (#CCL-185, Америка тибындагы культуралар коллекциясе) 10% FBS булган F-12K мохитендә үстерелде. SLC7A5ка юнәлтелгән кыска чәчле РНК (shRNA) эзлеклелекләре һәм максатчан булмаган контроль (NC) лентивирус векторы pLKO.1-puro эченә кертелде. shSLC7A5 антисенс эзлеклелекләре түбәндәгечә: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). SLC7A5ка (#5347) һәм тубулинга (#2148) антитәнчекләр Cell Signaling Technology компаниясеннән сатып алынды. SLC7A5ка һәм тубулинга антитәнчекләр Western blot анализы өчен 1:1000 нисбәтендә сыекландырылганда кулланылды.
Seahorse XF гликолитик стресс-тест күзәнәк тышындагы әчелек (ECAR) дәрәҗәсен үлчи. Анализда, ECAR ярдәмендә үлчәнгән күзәнәк гликолитик сәләтен тикшерү өчен, глюкоза, олигомицин А һәм 2-DG бер-бер артлы бирелде.
Максатчан булмаган контроль (NC) һәм shSLC7A5 (Sh1, Sh2) белән трансфекцияләнгән A549 күзәнәкләре төн буена 10 см диаметрлы савытларга салынды. Күзәнәк метаболитлары 1 мл бозлы 80% сулы метанол белән экстракцияләнде. Метанол эремәсендәге күзәнәкләр кырылып алынды, яңа пробиркага җыелды һәм 15000 × g тизлектә 4°C температурада 15 минут центрифугаланды. 800 мкл өслек сыекчасын җыйыгыз һәм югары тизлекле вакуум концентраторы ярдәмендә киптерегез. Аннары киптерелгән метаболит гранулалары югарыда тасвирланганча LC-MS/MS кулланып триптофан дәрәҗәләренә анализланды. A549 күзәнәкләрендәге (NC һәм shSLC7A5) күзәнәк NAD(H) дәрәҗәләре җитештерүче күрсәтмәләренә туры китереп, санлы NAD+/NADH колориметрик комплекты (#K337, BioVision) ярдәмендә үлчәнде. Метаболитлар күләмен нормальләштерү өчен һәр үрнәк өчен аксым дәрәҗәләре үлчәнде.
Өлге күләмен алдан билгеләү өчен бернинди статистик ысуллар да кулланылмаган. Биомаркерларны ачуга юнәлтелгән элеккеге метаболомика тикшеренүләре15,18 үлчәмне билгеләү өчен эталоннар буларак каралган, һәм бу отчетлар белән чагыштырганда, безнең үрнәк җитәрлек булган. Тикшеренү когортасыннан бернинди үрнәк тә чыгарылмаган. Максатчан булмаган метаболомика тикшеренүләре өчен сыворотка үрнәкләре очраклы рәвештә ачыш төркеменә (306 очрак, 74,6%) һәм эчке валидация төркеменә (104 очрак, 25,4%) билгеләнгән. Шулай ук, максатчан метаболомика тикшеренүләре өчен һәр төркемнән 70 очракны очраклы рәвештә сайладык. Тикшерүчеләр LC-MS мәгълүматларын җыю һәм анализлау вакытында төркем билгеләүдән мәхрүм калганнар. Метаболомика мәгълүматларының һәм күзәнәк экспериментларының статистик анализлары тиешле Нәтиҗәләр, Рәсем Легендалары һәм Методлар бүлекләрендә тасвирланган. Күзәнәк триптофанын, NADT һәм гликолитик активлыкны санлаштыру өч тапкыр бәйсез рәвештә башкарылды, нәтиҗәләр бер үк иде.
Тикшеренү дизайны турында тулырак мәгълүмат алу өчен, әлеге мәкалә белән бәйле Табигый портфолио отчетының аннотациясен карагыз.
Алынган үзенчәлекләрнең чимал MS мәгълүматлары һәм эталон сыворотканың нормальләштерелгән MS мәгълүматлары өстәмә мәгълүматлар 1 һәм өстәмә мәгълүматлар 2дә күрсәтелгән. Дифференциаль үзенчәлекләр өчен иң югары аннотацияләр өстәмә мәгълүматлар 3тә күрсәтелгән. LUAD TCGA мәгълүматлар җыелмасын https://portal.gdc.cancer.gov/ сайтыннан йөкләп алырга мөмкин. Графикны төзү өчен керү мәгълүматлары чыганак мәгълүматларында бирелгән. Чыганак мәгълүматлары бу мәкалә өчен бирелгән.
Милли үпкә скринингын өйрәнү төркеме һ.б. Түбән дозалы компьютер томографиясе ярдәмендә үпкә яман шешеннән үлем очракларын киметү. Төньяк Англия. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Крамер, Б.С., Берг, К.Д., Аберле, Д.Р. һәм Пропет, П.К. Түбән дозалы спираль компьютер томографиясе ярдәмендә үпкә яман шешен скрининглау: Милли үпкә скринингы тикшеренүе (NLST) нәтиҗәләре. J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
Де Конинг, Х.Дж. һ.б. Очраклы сынауда күләмле компьютер томографиясе ярдәмендә үпкә яман шешеннән үлем очракларын киметү. Төньяк Англия. J. Med. 382, 503–513 (2020).
Бастырылган вакыты: 2023 елның 18 сентябре