Кластерлаштырылган даими рәвештә үзара бәйләнешле кыска палиндромик кабатлаулар (CRISPR) - югары җитештерүчәнлекле нәтиҗәләре белән дөньяны революциягә китергән өченче буын геномны редакцияләү ысулы. Ул төрле биологик авыруларны һәм инфекцияләрне дәвалау өчен кулланылган. Төрле бактерияләр һәм башка прокариотлар (мәсәлән, археялар) да фаглардан саклану өчен CRISPR/Cas9 системаларына ия. CRISPR/Cas9 нигезендәге стратегияләр потенциаль рәвештә үзгәртелгән каршылык геннарын, транскрипцияне һәм эпигенетик көйләүне максат итеп куеп, өчләтә тискәре күкрәк яман шешенең (TNBC) үсешен һәм үсешен тоткарлый ала дип хәбәр ителә. Бу терапевтик чаралар хәтта TNBCда да күзәтелгән даруларга чыдамлык кебек катлаулы проблемаларны хәл итәргә ярдәм итә ала. Хәзерге вакытта CRISPR/Cas9ны максатлы күзәнәкләргә җиткерү өчен төрле ысуллар кулланыла, мәсәлән, физик (микроинъекция, электропорация һәм гидродинамик режимнар), вируслы (адено белән бәйле вирус һәм лентивирус) һәм вируссыз (липосомалар һәм липид нанокисәкчәләре). )-кисәкчәләр). TNBC молекуляр сәбәпләрен өйрәнү өчен төрле модельләр эшләнгән булса да, in vivo геномны редакцияләү коралларын тәкъдим итү өчен сизгер һәм максатчан ысулларның булмавы аларның клиник кулланылышын чикли. Кыскасы, бу күзәтү CRISPR/Cas9 ысулы белән TNBC дәвалавының барышын, кыенлыкларын, чикләүләрен һәм перспективаларын гамәлдәге дәлилләргә нигезләнеп җентекләп тикшерә. Шулай ук, ясалма интеллект һәм машина белән өйрәнүнең TNBC дәвалавында CRISPR/Cas9 стратегияләрен ничек яхшырта алуын да ассызыклыйбыз.
Рак контрольсез күзәнәк бүленеше, күзәнәк циклы контроль нокталарының бозылуы һәм шеш супрессор геннарында (TSGs) мутацияләр белән характерлана (Matthews et al., 2022). Ракның төрле төрләре арасында күкрәк рагы хатын-кызларда иң еш очрый торган яман шеш төре булып тора һәм дөнья күләмендә югары үлем күрсәткеченә ия (Waks and Winer, 2019). Күкрәк рагы - гистологик һәм биологик үзенчәлекләр, клиник күренешләр һәм үз-үзеңне тоту, дәвалауга җавап кебек төрле үзенчәлекләргә ия булган гетероген авыру (Weigelt et al., 2010). Күкрәк рагы классификациясе күкрәк рагы диагнозы һәм шеш фаразы өчен төгәл мәгълүмат бирә. Гомуми биомаркерларны һәм клиник-патологик үзенчәлекләрне куллану күкрәк рагы классификациясенең төп критерийы булып тора (Tsang and Tse, 2019). Күкрәк рагы фаразына һәм дәвалауга җавапка күп факторлар тәэсир итә, шул исәптән эстроген рецепторы (ER), прогестерон рецепторы (PR), кеше эпидермаль үсеш факторы 2 рецепторы (HER2/neu), һәм гистологик дәрәҗә, шеш төре һәм дәрәҗәсе. зурлыгы һәм лимфа төеннәренең метастазы (Әл-Тубайти, 2020). Күкрәк яман шешенең биш эчке молекуляр төре ачыкланган, шул исәптән люминаль А, люминаль В, HER2 белән баетылган, базаль-сыман һәм клаудин-түбән (Прат һ.б., 2015). TNBC - барлык ER, PR һәм HER2 ны да белдермәгән яман шешнең молекуляр төре (Йин һ.б., 2020). Бу патологик үзенчәлекләр TNBC белән бәйле, бу аның тиз үсешен һәм башка теләсә нинди күкрәк яман шешенә караганда агрессиврак табигатен раслый (Фен һ.б., 2018). Моннан тыш, Перу һ.б. (2000) күкрәк яман шешен яңадан классификацияләү һәм күкрәк яман шешенең биш эчке төрен билгеләү өчен микрочип технологиясен кулланганнар (Каденас, 2012). Базаль-сыман күкрәк яман шеше - өчләтә тискәре фенотипка ия булган һәм тиз үсеше белән бәйле күкрәк яман шешенең бер төре. Шунысын да билгеләп үтәргә кирәк, барлык базаль-сыман күкрәк яман шешләре дә гадәттә TNBC дип ялгыш диагноз куела, ләкин аларның нибары 77% ы гына TNBC; Киресенчә, TNBCларның 71–91% ы базаль-сыман, бу күкрәк яман шешенең бу ике төре бер-берсенә туры килүен һәм төрле классификацияләрне күрсәтүен күрсәтә (Wang D.-Y. һ.б., 2019). Бу фаразны ачыклау һәм хәзерге һәм киләчәк дәвалауга потенциаль җавапларны билгеләү өчен TNBCның гетерогенлыгын характерлау зарурлыгын тудыра. Моннан тыш, TNBC күкрәк яман шешенең барлык очракларының 15–20% ын тәшкил итә һәм 50 яшькә кадәрге хатын-кызларда ешрак очрый. BRCA1 яки BRCA2 мутацияләре TNBC очракларының якынча 20% ында теркәлгән (Xie һ.б., 2017; Tzikas һ.б., 2017). , 2020). Тикшеренүләр шулай ук TNBC'ның кан тамырлары эндотелиаль үсеш факторларының, шеш белән бәйле макрофагларның (TAM), шешкә инфильтрацияләүче лимфоцитларның (TIL) һәм шеш үсешендә һәм миграциясендә катнашучы башка молекулаларның югары дәрәҗәсен үз эченә алган аерым иммун микротирәлегенә ия булуын күрсәтте. Шуңа күрә, TNBC'ның микротирәлеген аңлау аның фаразын һәм дәвалавын тәэмин итү өчен бик мөһим (Fan һәм He, 2022).
TNBC фаразын бәяләү һәм нәтиҗәле дәвалауны тәэмин итү өчен, нигездә, ER, PR һәм HER2 ачыклау өчен иммуногистохимиягә (IHC) һәм күкрәк неоплазмаларын ачыклау өчен маммографиягә нигезләнгән төгәл диагноз кую мөһим. Ләкин маммография некроз һәм фиброз кебек эчке шеш үзенчәлекләрен тиешенчә күрсәтә алмый (Deepak Singh et al., 2021). Начар фараз һәм диагноз табибларга дөрес дарулар билгеләргә комачаулаганлыктан (Chaudhary, 2020), TNBC белән авыручыларга ярдәм күрсәтүне яхшырту өчен төрле стратегияләр кулланыла. Хәзерге вакытта TNBC белән авыручыларда ике препарат, доксорубицин һәм циклофосфамид кулланыла һәм яхшы нәтиҗәләр күрсәттеләр. Моннан тыш, карбоплатин һәм цисплатин кебек башка платина препаратлары кулланыла (Sikov et al., 2015). Моннан тыш, Olaparib, Velaparib һәм PF-01367338 кебек PARP ингибиторлары TNBCны дәвалау өчен потенциаль химиотерапия препаратлары буларак кулланылды (Ishino et al., 2018). Wnt/b-Catenin, NOTCH һәм Hedgehog сигнал юлларының TNBC барлыкка килүендә һәм үсешендә катнашуы турында хәбәр ителгәнлектән, бу юлларга даруларны юнәлтү мөһим стратегия булырга мөмкин (Aysola et al., 2013). Бүгенге көндә TNBC өчен хирургия, нур терапиясе һәм химиотерапия төп дәвалау булып калса да, максатчан терапия, иммунотерапия, Cas9n, dCas9 кебек төрле CRISPR белән бәйле геннарны редакцияләү кораллары, CRISPR/Cas12, төп редакцияләү һәм CRISPR/Cas9 белән юнәлтелгән ген терапиясе кебек яңа дәвалау ысулларын эшләүдә зур уңышларга ирешелде. Монда без TNBC дәвалауда кулланыла торган төрле CRISPR белән бәйле геннарны редакцияләү коралларына игътибар итәчәкбез. Алар арасында CRISPR/Cas9 киң игътибар җәлеп итте.
Cas9n, шулай ук Cas9 никаза буларак та билгеле, CRISPR/Cas9 геномын редакцияләү системасыннан алынган Cas9 аксымының генетик яктан үзгәртелгән варианты (Gupta et al., 2019). Башлангыч формасында Cas9 аксымы ике нуклеаза доменын үз эченә ала: RuvC һәм HNH, аларның төп функциясе - ике ДНК җепләренең дә өзелүе. Ләкин Cas9n'да нуклеаза доменнарының берсе, HNH, генетик яктан мутацияләнә һәм актив түгел була. Шуңа күрә Cas9n'ның HNH домены эшләми кала. Бары тик RuvC домены гына актив булып кала, бу Cas9n'га бер ДНК җепләрендә өзеклекләрне кисәргә яки булдырырга мөмкинлек бирә (Trevino and Zhang, 2014). Cas9 белән чагыштырганда, Cas9n максаттан тыш эффектларны нәтиҗәле рәвештә киметә һәм күзәнәкне төзәтү механизмнарын төгәл яхшырта ала. Cas9n төрле проблемаларны чишү өчен кулланылырга мөмкин, мәсәлән, ике җепле ДНК'да билгеле бер урыннарда өзеклекләр булдыру. Моның өчен ике Cas9n молекуласы берләштерелде һәм бергә кулланылды (Yee, 2016). Катнаш линия киназа 3 (MLK3) - TNBC метастазлары вакытында төп регулятор булып хезмәт итүче митоген белән активлаштырылган протеин киназа (Cronan et al., 2012).
MLK3 TNBC метастазына китерә торган берничә сигнал юлын активлаштыра ала. Мәсәлән, c-Jun N-терминаль киназа (JNK) юлы күзәнәк хәрәкәтчәнлеген һәм тышкы матрица деградациясен көйли, ә MLK3 JNK юлын активлаштыра, шуның белән күзәнәк хәрәкәтчәнлеген көчәйтә һәм инвазив үзлекләр бирә (Rattanasinchai һәм Gallo, 2016). MLK3 шулай ук EMTны көйли. Моның өчен ул Snail, Slug һәм Twist кебек транскрипция факторларын активлаштыра. Бу факторлар эпителиаль маркерларның экспрессиясен тоткарлый һәм мезенхималь маркерларның экспрессиясен стимуллаштыра, метастатик фенотип алуга китерә (Casalino et al., 2023). MLK3 ECM ремоделизациясендә һәм ECMны деградацияләүче матрица металлопротеиназалары (MMP) кебек протеазаларның активлашуында роль уйный дип күзәтелгән. Бу шеш күзәнәкләренең инвазиясен һәм ерак урыннарга таралуын җиңеләйтә (Katari et al., 2019). Шулай итеп, алдагы тикшеренүләр MLK3 нең TNBCда мөһим роль уйнавын күрсәтте. Раттанасинчай һәм Галло MLK3 ролен өйрәнү өчен TNBC модельләрен кулланганнар һәм аның билгеле бер сигнал юллары аша яман шеш үсешенә ярдәм итүен ачыклаганнар. Алар MLK3'не редакцияләү өчен CRISPR/Cas9n кулланганнар һәм TNBC метастазларының сизелерлек кимүен күзәткәннәр (Раттанасинчай һәм Галло, 2016).
dCas9, еш кына актив булмаган Cas9 дип атала, Cas9 аксымының модификацияләнгән туынды формасы. Актив Cas9дан аермалы буларак, dCas9 эндонуклеаза активлыгына ия түгел, шуңа күрә ул ДНК ике чылбырлы өзеклекләрне китереп чыгара алмый. Шуңа күрә, dCas9 геномның билгеле бер өлкәләренә төгәл юнәлтелгән, ДНК эзлеклелегендә бернинди үзгәрешләр яки модификацияләрсез кулланылырга мөмкин (Wang et al., 2016). dCas9да ике эндонуклеаза аксымы, RuvC һәм HNH, мөһим аминокислота калдыкларын бастыру юлы белән активлаштырылмый. (Richter et al., 2016). ДНК бүленеш активлыгы җитмәүгә карамастан, dCas9 генетик тикшеренүләрдә һәм биотехнологиядә берничә мөһим роль уйный. Мәсәлән, ул геномның билгеле бер өлкәләрен визуализацияләргә мөмкинлек бирә, транскрипция регуляторын җиңеләйтә һәм эпигенетик модификацияләргә ярдәм итә (Brocken et al., 2018).
Транскрипция факторы ZEB1 (цинк бармак E-тартмасын бәйләүче гомеобокс 1) эпителиаль-мезенхималь күчешне (ЭМК) җайга салуда специфик һәм мөһим роль уйный, бу эмбриональ үсеш, тукымаларны торгызу һәм яман шеш үсеше вакытында барлыкка килә торган күзәнәк процессы. Ул эпителиаль күзәнәкләрнең мезенхималь күзәнәкләргә әверелүен үз эченә ала, нәтиҗәдә күзәнәк морфологиясе, хәрәкәтчәнлеге, инвазивлыгы һ.б. үзгәрә (Wu һ.б., 2020). ZEB1 күп эпителиаль маркерларны, мәсәлән, E-кадгерин һәм окклюдинны тоткарлый, алар TNBCда күзәнәк-күзәнәк адгезиясен һәм эпителиаль күзәнәкләрнең полярлыгын саклау өчен җаваплы (Moreno-Bueno һ.б., 2008). Моннан тыш, ZEB1 N-кадгерин, виментин һәм фибронектин кебек кайбер маркерларны активлаштыра (Konradi һ.б., 2014), шулай ук Rho GTPaza һәм матрица металлопротеиназалары (MMPs) кебек цитоскелет ремоделингында катнашкан геннарны көйли (Huang). һ.б., 2014). 2022), моннан тыш, ул төрле сигнал юлларына, мәсәлән, трансформацияләүче үсеш факторы-β (TGF-β), Wnt сигналлаштыру һ.б. тәэсир итә, шуның белән TNBCда шеш инвазиясен һәм метастазларын стимуллаштыра (Chen et al., 2016). Күп санлы тикшеренүләр һәм фәнни дәлилләр ZEB1ның TNBCны ачыклау һәм терапевтик ярдәм күрсәтү өчен кыйммәтле агент буларак зур потенциалга ия булуын күрсәтә. Күптән түгел үткәрелгән тикшеренүдә Waryah et al. TNBC моделен кулланды һәм dCas9 белән ZEB1ны тулысынча бастыруга иреште. Шулай итеп, алар in vivo шартларында ZEB1ның бик югары спецификасын һәм диярлек тулысынча ингибирлавын күзәттеләр (Waryah et al., 2023).
CRISPR/Cas12 - CRISPR/Cpf1 дип аталган генны редакцияләү коралы. Ул CRISPR/Cas системасыннан алынган, анда Cas12 термины CRISPR белән бәйле 12 аксымына карый (Bharathkumar et al., 2022), ул Cas9га тулысынча охшаган. Бердәнбер аерма шунда ки, ул Cas12 аксымын үз эченә ала. Cas9 белән чагыштырганда, Cas12 кайбер уникаль функцияләргә ия, мәсәлән, генны редакцияләү процессында ябышчаклы очлар барлыкка китерә, ә Cas9 тупас очлар барлыкка китерә (Wang et al., 2021). Cas12-нең бу үзенчәлеге аның ДНК манипуляцияләү технологиясенә өлеш кертә. Максатлы ДНКны төгәл таный һәм кисә ала торган аксым буларак, ул гаҗәеп күпкырлылыкка ия, бу аны төрле кушымталар, шул исәптән генны редакцияләү өчен нәтиҗәле корал итә (Pickar-Oliver һәм Gersbach, 2019).
Башка CRISPR вариантлары кебек үк, CRISPR/Cas12 шулай ук TNBC геннарын юкка чыгарырга яки активлаштырырга сәләтле, аның патогенезында яки дәвалауга җавап бирүендә мөһим роль уйнаган геннарны максат итеп куя (Yang and Zhang, 2023). Бу процессны башкару өчен, Cas12 генын максатлы генга юнәлтүче юнәлеш бирүче РНК (gRNA) эшләнгән. Cas12 үз максатына бәйләнгәч, ул ДНКда ике чылбырлы өзеклекләр кертә һәм ДНКны төзәтү механизмнарын активлаштыра. Ремонт процессы вакытында дөрес булмаган нуклеотидлар кертелергә мөмкин, бу ген мутацияләренә һәм функциянең югалуына китерә (Zhang et al., 2021a). Моннан тыш, геннарны активлаштыру өчен Cas12 ферментының яхшыртылган версиясе (dCas12 дип атала) да кулланылган. Аны транскрипция активаторы белән берләштереп, билгеле бер геннарны индукцияләргә, шуның белән аларны активлаштырырга мөмкин. Бу технология шешне бастыручы геннарны активлаштыруда зур потенциалга ия (Sultan et al., 2022).
Прайм-монтаж - яңа эшләнгән һәм бик югары сыйфатлы геном-монтажлау технологиясе. Ул организмның ДНКсын бик төгәл үзгәртә ала (Chen һәм Liu, 2023). Прайм-монтажлау ике төп компонентны интеграцияләү аша тормышка ашырыла: модификацияләнгән CRISPR/Cas9 ферменты һәм кире транскриптаза. CRISPR/Cas9 ферментының роле - геномдагы төгәл урыннарны сайлап билгеләү, ә кире транскриптаза ДНКны максатлы урында тулысынча үзгәртүгә ярдәм итә (Hassan et al., 2021). Прайм-монтажлау механизмында беренче адым праймер-монтажлау кулланмасы РНКсын (pegRNA) булдыруны үз эченә ала (Standage-Beier et al., 2021). Ул максатлы ДНКдагы теләгән редакцияләү урынына туры килә торган максатлы эзлеклелекне һәм РНК шаблонын үз эченә ала. Аннары pegRNA максатлы күзәнәкләргә праймер-монтажлау нуклеазасы (PE2) белән бергә кертелә. PE2 - Cas9 ферментыннан, кире транскриптазадан һәм праймер-монтажлау адаптерыннан торган кушылу аксымы (Martín-Alonso et al., 2021). Күзәнәк эчендә pegRNA һәм PE2 комплекслары үзгәртергә теләгән конкрет ДНКны эзли. Cas9 ферменты ДНКны кисә һәм бер чылбырдан торган шаблон булдыра (Choi et al., 2022). Кире транскриптаза бу шаблонны ДНКны редакцияләүгә әзерләү өчен куллана. ДНКны күчерү белән беррәттән, РНК шаблонын редакцияләү буенча күрсәтмәләр дә кертелгән. Ниһаять, яңа булдырылган ДНК чылбыры ДНКдагы өзеклекне төзәтү өчен шаблон буларак кулланыла, нәтиҗәдә теләгән модификацияне үз эченә алган үзгәртелгән ДНК эзлеклелеге барлыкка килә (Ochoa-Sanchez et al., 2021). Праймерны редакцияләү механизмнары геннарда киң таралган мутацияләргә китерергә мөмкин. Ул нокта мутацияләренә, инсерцияләргә, делецияләргә һәм хәтта ген алмаштыруларына юнәлтелгән булырга мөмкин (Anzalone et al., 2019; Chen and Liu, 2023). Прайм-редакторлау элеккеге геномны редакцияләү технологияләренә караганда берничә өстенлек бирә. Алар арасында төгәллекне арттыру, максаттан тыш эффектларны киметү һәм ДНКның ике чылбырлы өзекләренә таянмыйча ДНКны редакцияләү мөмкинлеге бар (Anzalone et al., 2020).
CRISPR/Cas9 технологиясе башта бактерияләрне плазмид күчерүеннән һәм фаг инфекциясеннән саклау өчен эшләнгән, соңрак геномны редакцияләү өчен нәтиҗәле РНК нигезендәге ДНКны максат итеп кую коралы буларак яңадан кулланылган (Jiang һәм Doudna, 2017). Моннан тыш, CRISPR/Cas9 системасы бактерия һәм архей геномнарының 50% һәм 87% ында булуы турында хәбәр ителгән (Ishino et al., 2018). CRISPR/Cas9 - in vivo һәм in vitro режимнарын кулланып, теләсә нинди аномаль генетик эзлеклелекне бетерү, кертү һәм төзәтү өчен потенциаль корал (Sabit et al., 2021). Моннан тыш, CRISPR/Cas9 адаптив иммун системасының бер өлеше булып тора, чөнки ул кызыксыну уяткан максатлы геннар өчен спецификалы (Chen һәм Zhang, 2018).
CRISPR/Cas9 Cas9 һәм бер юнәлеш бирүче РНКдан (sgRNA) тора. Cas9 - күп аксым компонентларыннан торган эндонуклеаза. Моннан тыш, Cas9 уникаль структураль һәм конформация үзенчәлекләренә ия (Pacesa et al., 2022), чөнки ул ике өлештән тора: тану (REC) һәм нуклеаза (NUC). REC өлеше тагын өч өлкәгә бүленә: REC1, REC2 һәм күпер спиральләре (Cromwell et al., 2018). NUC өч өлештән тора, атап әйткәндә, RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH һәм протоспейсер янындагы мотив (PAM) үзара бәйләнеш өлкәсе (1 нче рәсем) (Song et al., 2016). sgRNA ике компоненттан тора, шул исәптән CRISPR РНК (crRNA) һәм транскодлаучы кечкенә РНК (интерьер РНК) (1 нче рәсем). sgRNA Cas9 аксымын коннексиннар белән тоташтырып, актив комплекс барлыкка китерә, ул шулай ук эффектор комплексы дип тә атала (Richter et al., 2012). crRNA - максатлы ДНК эзлеклелеген тануда мөһим роль уйный торган 18–20 нуклеотидлы нигез пары. Моннан тыш, crRNA максатлы ДНК белән парлаша, һәм tracrRNA Cas9 нуклеазасы өчен максатлы ДНКга бәйләнү өчен нигез булып тора (Manghwar et al., 2019). Икенче яктан, PAM эзлеклелегендә 3 нуклеотид бар, бу эффектор комплексының ДНКга бәйләнүне раслый, билгели һәм арадашчылык итә. Cas9 аксым комплексы субберәмлекләре RuvC һәм HNH каталитик активлыкка ия (Richter et al., 2012; Asmamaw һәм Zawdie, 2021). Cas9 субберәмлегенең HNH нуклеаза домены crRNA белән бәйле ДНК җебен өзә. RuvC нуклеаза домены башка ДНК җепләрен өзә һәм ике җепле өзеклекләр (DSB) барлыкка китерә, шуннан соң ике төрле ДНК өзекләрен төзәтү механизмы активлаша (Jiang and Doudna, 2017) (1 нче рәсем).
1 нче рәсем. CRISPR/Cas9 гомуми күзәтүе (A). CRISPR/Cas9 системасының компонентлары: (i). Cas9 эндонуклеазасы максатлы ДНК эзлеклелеген кисү өчен җаваплы, (ii) crRNA һәм tra-crRNA химераларының кушылуы нәтиҗәсендә барлыкка килгән бер юнәлешле (sg) РНК. (ике). Cas9 составына Rec I, Rec II, NUC лоб (HNH һәм Ruv C субкомпонентлар) һәм тиешле функцияләре булган PAM үзара бәйләнеш домены (C) кебек берничә компонент керә. CRISPR/Cas9 аксым комплексы ДНК эзлеклелеген комплементар булмаган һәм комплементар формаларга (D) бүлә. CRISPR/Cas9 геномны өч этапта үзгәртә: тану, кисү һәм ремонтлау. Эшләнгән sg-РНК Cas9ны җитәкли һәм кирәкле эзлеклелекне комплементар компонент crRNA аша таный. Cas9 PAM эзлеклелеген 5′-NGG-3′ да таный һәм ДНКны эретә, ДНК-РНК гибридын формалаштыра һәм бүленешне активлаштыра. Cas9ның HNH домены комплементар җепне өзә, ә RuvC домены комплементар булмаган җепне өзә. CRISPR/Cas9 dsДНКны ике ысул белән өзеп төзәтә: гомологик булмаган очлы тоташу (NHEJ) һәм гомологиягә юнәлтелгән ремонт (HDR). NHEJ ике җепле ДНКны чит гомологик ДНК булмаганда ферментатив процесс аша төзәтә, бу очраклы ДНК эзлеклелеген кертә яки бетерә ала торган хатага бирешүчән механизм. HDR бик специфик һәм гомологик ДНК шаблоннарын таләп итә.
CRISPR/Cas9 ярдәмендәге ремонт юлларына гомологик булмаган очлар кушылуы (NHEJ) һәм гомологиягә юнәлтелгән ремонт (HDR) механизмнары керә. NHEJ хаталарга бирешүчән юл, чөнки ул кертү яки бетерүне үз эченә ала һәм ремонт механизмы вакытында бернинди үрнәк таләп итми. Ул стандарт аксымнарны булдыру өчен очраклы нуклеотидлар куллана (Abbasi et al., 2021). Бу ремонт системасы дүрт комплекстан тора, мәсәлән, KU комплексы, 4 нче типтагы үзара комплементацияләүче аксым комплексы (XRCC-4), ДНК ахырын эшкәртү ферменты һәм аксым киназасы ДНК-PKcs (Abbasi et al., 2021). KU комплексы аксымының ике субберәмлеге бар: Ku 70 һәм Ku 80, һәм ул NHEJ механизмында мөһим роль уйный, чөнки репарация механизмы максатлы ДНКның тупас яки диярлек тупас очларына ике субберәмлекнең (Ku 70 һәм Ku 80) бәйләнүе белән башлана (Abbasi et al., 2021), алар NHEJ белән бәйле башка факторларны җәрәхәт урынына җәлеп итү өчен корал булып хезмәт итә (Yang et al., 2020). XRCC-4 һәм ДНК лигазалары, тиешенчә, 334 һәм 911 аминокислотадан тора, һәм XRCC4-ДНК лигаза IV комплексы ДНК очларының бәйләнүен стимуллаштыра (Chatterjee et al., 2015). ДНК эшкәртү ферменты, шулай ук полинуклеотид киназа 3′-фосфат буларак та билгеле, ДНК эшкәртү ферменты. Ул ДНКдагы 3′P төркемен бетерә һәм DSB ремонты вакытында 5′OH төркемен фосфорлаштыра ала. Ул шулай ук SSB ремонтлау юлын кулланып бер чылбырлы өзеклекләрне (SSB) төзәтүне үз эченә ала (Chatterjee et al., 2015). Аксым киназасы ДНК-PKcs - ДНКга бәйле протеин киназасы, ул PIKKларның (фосфатидилинозитол 3-киназа белән бәйле киназалар) каталитик субберәмлегеннән һәм атаксия телангиэктазия мутацияләнгән (ATM) гаиләсеннән, шулай ук ATM һәм Rad3 белән бәйле ATRлардан тора. Чылбырлы өзеклекләр (DSB) һәм бер чылбырлы өзеклекләр (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
HDR - төгәлрәк һәм яраклырак төзәтү механизмы, чөнки мәгълүмат гомологик ДНК дуплексының сакланган формасы ярдәмендә күчерелә, гәрчә ул апа-хроматидларның булуын таләп итсә дә. Бу имезүчеләр күзәнәк циклының S/G2 фазасында була. HDR, нигездә, чүпрә төрләрендә очрый, ләкин NHEJ имезүчеләрдә бик мөһим (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). Тулы төзәтү механизмы 1 нче рәсемдә күрсәтелгән.
TNBC генетик һәм эпигенетик аномалияләр аркасында килеп чыкканлыктан, CRISPR/Cas9 кулланып яман геном/эпигеном аномалияләрне төзәтү акыллы терапевтик ысул булырга мөмкин (Chen et al., 2019). Моннан тыш, күзәнәккә хас транскрипция көйләүдә катнашкан кайбер транскрипция факторлары яман шеш күзәнәкләренең уникаль үзенчәлекләрен күрсәтергә мөмкин, бу транскрипция көйләү яман шешне дәвалау өчен бик яхшы ысул булырга мөмкин дигәнне аңлата (Drost et al., 2017). Дарулар эшләү өчен шешләрнең бу молекуляр үзенчәлекләрен, мәсәлән, генетик, эпигенетик һәм транскрипция җитешсезлекләрен файдалану клиник нәтиҗәләрне яхшыртырга һәм скрининг чыгымнарын киметергә мөмкин. CRISPR - яман шеш китереп чыгаручы геном максатларын ачыклау һәм билгеләү өчен генә түгел, ә кеше күзәнәкләрендә онкогеннарны редакцияләү, бастыру һәм эпигенетик яктан үзгәртү өчен дә кулланылырга мөмкин булган потенциаль ген редакцияләү коралы (1 нче таблица) (Ahmed et al., 2021). Шеш супрессорлары, онкогеннар һәм даруларга чыдамлык белән бәйле геннарны эзләү өчен берничә CRISPR скринингы үткәрелде. Төрле TNBC онкогеннарын үзгәртү өчен CRISPR/Cas9 куллану 2 нче рәсемдә күрсәтелгән.
2 нче рәсем. CRISPR/Cas9 кулланып төрле TNBC онкогеннарын генлаштыру, нәтиҗәдә шеш үсеше һәм метастазлары кимегән. Бу онкогеннарга CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 һәм CXCR7, Crypto1, ROR1 һәм ST8SIA керә, алар TNBC барлыкка килүендә һәм метастазлануында катнаша.
Рак күзәнәкләренең миграциясе, инвазиясе һәм эпителиаль-мезенхималь күчеш (ЭМТ) ITGA9 белән бәйле. Элегерәк үткәрелгән тикшеренүләр ITGA9ның Нотч юлында төп роль уйнавын һәм рабдомиосаркома метастазында кызыклы роль уйнавын күрсәтте (Molist et al., 2020). Моннан тыш, ITGA9 берничә шеш төрендә, шул исәптән күкрәк яман шешендә пациентларның фаразы белән тыгыз бәйләнештә булуы ачыкланды (Wang Z. et al., 2019). Моннан тыш, ITGA9ның биоинформатик анализы аның TNBCда экспрессиясенең башка күкрәк яман шеше төрләренә караганда күпкә югарырак булуын күрсәтте. ITGA9 дәрәҗәләренең югары булуы TNBC пациентларында шеш метастазлары һәм рецидив белән бәйле. CRISPR/Cas9 ярдәмендә ITGA9ны нокаутлау яман шеш күзәнәкләренә (CSC) охшаган үзенчәлекләргә, шеш ангиогенезына, шеш үсешенә һәм TNBCда β-катенин деградациясен стимуллаштыру юлы белән метастазны киметүгә китерде (Wang Z. et al., 2019).
Крипто-1 TGF-β гаиләсенең әгъзасы һәм эмбриогенезның иртә этабы, күзәнәк күзәнәкләрен саклап калу һәм яман шеш метастазлары өчен бик мөһим (Ishii et al., 2021). Tdgf-1 буларак та билгеле, ул - башлангыч сызык, мезодерма һәм эндодерма формалашуын көйләүдә, шулай ук эмбриогенез вакытында тән органнары үсешендә сул/уң асимметрияне урнаштыруда катнашкан онкоген GPI белән бәйләнгән сигналлаштыручы аксым (Zhang et al., 2021b). Моннан тыш, Крипто-1 күзәнәк маркеры буларак эпителиаль-мезенхималь күчештә (EMT) катнашуы күрсәтелгән (Zhang et al., 2021b). EMT эмбриональ үсеш, фиброз һәм яраларны төзәлү кебек төрле процесслар өчен генә түгел, ә яман шеш инвазиясе һәм метастазлары өчен дә бик мөһим. Моннан тыш, Крипто-1 дүрт Notch рецепторы белән үзара бәйләнештә булуы һәм аларның трансляциядән соңгы өлгерүен көчәйтүе күрсәтелгән (Brandstadter һәм Maillard, 2019). Notch сигнал юлының кеше күкрәк яман шеше күзәнәкләрен саклап калуда катнашуы билгеле. Тикшеренүләр күрсәткәнчә, Crypto-1 нең CRISPR/Cas9 аша нокаутка җибәрелүе яман шеш үсешен һәм метастазларны баса. Шуңа күрә, Crypto-1 TNBC өчен мөһим терапевтик максатка әйләнергә мөмкин (Castro et al., 2015).
XCL12 аксымы һәм аның хемокин рецепторы CXC (CXCR4 һәм CXCR7) яман шеш күзәнәкләренең пролиферациясендә, үсешендә, миграциясендә һәм инвазиясендә төрле роль уйный (Wu һ.б., 2015). Бу хеморецепторлар in vivo һәм in vitro модельләрендә күп сигнал юллары аша TNBC үсеше белән бәйле (Wu һ.б., 2015). Моннан тыш, CXCR4 һәм CXCR7 активлашуы TNBCда метастазга күбрәк бирешүчәнлек һәм начар фараз белән бәйле (Karn һ.б., 2022). Шуңа күрә, CXCR4 һәм CXCR7 нокаутлары күкрәк яман шешен, шул исәптән TNBCны дәвалау өчен нәтиҗәле дару максат геннарына әйләнергә мөмкин. Ян һ.б. тарафыннан үткәрелгән тикшеренүдә Ян һ.б. (2019) CXCR4 һәм CXCR7 геннарын бергәләп нокаутлау өчен CRISPR/Cas9 кулланды һәм TNBC пролиферациясенең, үсешенең, миграциясенең һәм инвазиясенең сизелерлек тоткарлануын ачыклады (Yang һ.б., 2019).
Күкрәк яман шеше тукымаларында TNBC онкогены булган miR-3662 дәрәҗәсенең артуы күзәтелде (Yi һ.б., 2022). miR-3662 нокауны күкрәк яман шеше үсешен һәм метастазасын in vivo һәм in vitro шартларында тоткарлавы күрсәтелгән (Agarwal һәм Gupta, 2021). HBP-1 - Wnt/-катенин сигнализациясенең көчле ингибиторы һәм, мөгаен, TNBC күзәнәкләренең miR-3662 аша үсүе өчен җаваплы. Күптән түгел Йи һ.б. miR-3662-HBP1 күчәре TNBC күзәнәкләрендә Wnt/-катенин сигнализация юлын көйли икәнен ачыкладылар (Yi һ.б., 2022). Шешкә хас экспрессиясе аркасында, miR-3662 TNBC өчен потенциаль терапевтик максат булырга мөмкин. Шулай итеп, miR-3662нең CRISPR/Cas9 аша нокауны TNBCны дәвалау өчен яңа препаратлар эшләү өчен бик яхшы ысул булырга мөмкин.
UBR5 - төрле яман шеш авыруларында шеш барлыкка килү, метастаз һәм иммун җавапның төп регуляторы буларак билгеләнгән 300 кДа нуклеофосфопротеин (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023). UBR5 TNBC үрнәкләрендә югары дәрәҗәдә регуляторланган һәм убиквитин лигаза активлыгы аша пролиферацияне стимуллаштырып, ERα функциясен стимуллаштыра дип хәбәр ителә (Bolt et al., 2015). Беренчел TNBC үрнәкләренең тулы экзом секвенирлау тикшеренүләре дә UBR5 экспрессиясенең артуын күрсәтте, бу аның TNBC үсешендәге ролен күрсәтә. Моннан тыш, UBR5ның CRISPR/Cas9 ярдәмендә бетерелүе эксперименталь тычкан модельләрендә TNBC метастазының һәм үсешенең сизелерлек тоткарлануын күрсәтте. Моннан тыш, кыргый типтагы тычкан моделенә UBR5 кертү аның тулы функциональлеген торгызды, ә бу эффект инактивлаштырылган мутант штаммнарда күзәтелмәде (Liao et al., 2017). UBR5 җитмәү TNBCда апоптоз, некроз һәм ангиогенез начар булу сәбәпле шеш үсешен тоткарлау белән бәйле. UBR5 югалу сәбәпле, шешнең ерак органнарга таралуы кими, һәм UBR5, нигездә, E-кадгерин экспрессиясен киметү юлы белән аномаль EMT китереп чыгара (Zhang and Weinberg, 2018). Күптән түгел UBR5 TNBCда IFN-γ белән индукцияләнгән PDL1 транскрипциясендә бик мөһим фактор булып тора, чөнки аның E3 убиквитинация активлыгы җитми. РНК транскриптом анализы UBR5ның IFN-γ юлы белән бәйле геннарга системалы йогынты ясавын һәм протеин киназ РНК (PKR) һәм аның сигнал трансдукторлары һәм активаторларының активация дәрәҗәләрен арттыру юлы белән PDL1 трансактивациясен стимуллаштыруын күрсәтте. 1 нче транскрипция (STAT1) һәм 1 нче интерферон регулятор факторы (IRF1). Шулай да, CRISPR/Cas9 ярдәмендә UBR5 һәм PD-L1 экспрессиясенең берләштерелгән абляциясе, блокаданың теләсә кайсы ысулына караганда, синергетик терапевтик эффект бирә, шеш микротирәлегенә тирән йогынты ясый (Wu һ.б., 2022). Шулай итеп, CRISPR/Cas9 UBR5 функциясен тоткарлау өчен мөһим корал булырга мөмкин, шуның белән TNBC метастазын һәм шеш үсешен бастырырга мөмкин.
ROR1 - яман шеш һәм эмбриональ үсеш вакытында экспрессияләнә торган I типтагы трансмембран аксымы һәм ул онкофеталь аксым буларак билгеләнде (Николас Борчердинг, 2014). Төрле кеше яман шешләренең инвазив үз-үзен тотышы ROR1-ның артуы белән бәйле. ROR1-гә юнәлтелгән терапевтик кушылмаларны үз эченә алган in vivo һәм in vitro тикшеренүләреннән өметле нәтиҗәләр алынды (Chien et al., 2016). Күкрәк тукымалары биопсияләрендә ROR1 мРНК дәрәҗәләренең югары булуы шулай ук агрессив базальсыман күкрәк (BL) шешләре һәм аларның тәннең башка өлешләренә күчүе белән бәйле. Моннан тыш, ROR1-ның артык экспрессиясе TNBC үсеше өчен прогностик маркер буларак билгеләнде (Chien et al., 2016). Ләкин, TNBC үсешен һәм метастазларын бастыру өчен CRISPR/Cas9 кулланып ROR1-ны тындыру нәтиҗәле стратегия булыр иде.
Сиалиллаштыру процессы гликоконъюгатларга сиал кислотасын өстәүне үз эченә ала, ул сиалилтрансферазалар (ST) белән катализлана. ST8SIA1 ST гаиләсенә карый һәм лимфоцитар лейкемия һәм колоректаль яман шеш кебек төрле авыруларның патогенезында мөһим роль уйный (Chang et al., 2018). РНК эзлеклелеген анализлау күрсәткәнчә, ST8SIA1 TNBC пациентларының күкрәк тукымаларында югары дәрәҗәдә экспрессияләнә һәм шеш супрессоры p53 генындагы мутацияләр белән уңай корреляциягә ия, бу TNBC патогенезына өлеш кертә ала (Battula et al., 2017). Моннан тыш, ST8SIA1 TNBC метастазында һәм рецидивында катнаша, бу аның TNBC барлыкка килүендә һәм үсешендә мөһим роль уйнавын күрсәтә. TNBCның in vitro моделендә CRIPSR/Cas9 белән ST8SIA1 нокдаунының үсешне һәм метастазны блоклавы күрсәтелгән (Battula et al., 2017). Бу CRISPR/Cas9 TNBC дәвалауда ST8SIA1 онкогены функциясен тоткарлау өчен мөһим корал булырга мөмкин дигән фикерне аңлата.
NAT1 - II фаза ксенобиотик кушылмалары формалашуын катализлаучы метаболик фермент һәм ул диярлек барлык кеше тукымаларында да экспрессияләнә. NAT1 кофактор фолатын ацетил-КоА (ацетил-КоА) белән ароматик амин субстраты булмаганда да максатчан элемтәгә керә ала (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). Тикшеренүләр күрсәткәнчә, NAT1 күкрәк яман шеше күзәнәк модельләрендә матрица металлопротеиназа 9 (MMP9) функциясен көйли һәм глюкоза ачлыгы вакытында реактив кислород төрләрен (ROS) саклый (Wang et al., 2018). NAT1ны бетерү пируватдегидрогеназа комплексын тоткарлый, бу митохондрия дисфункциясенә китерә (Wang L. et al., 2019). Моннан тыш, башка төрле докладларда кечкенә молекулалар һәм siRNA тындыру ярдәмендә NAT1 ингибирлавы күкрәк яман шеше күзәнәкләренең инвазивлыгын һәм пролиферациясен киметергә мөмкин дип күрсәтелгән (Stepp et al., 2018). Күптән түгел CRISPR/Cas9 күкрәк яман шеше күзәнәк линиясендә MDA-MB-231да NAT1ны бастыру өчен кулланылды, бу аның экспрессия дәрәҗәсенә карап күзәнәк метаболизмына тәэсир итә. Бу тикшеренү шулай ук NAT-1нең TNBC үсеше һәм метастазы өчен бик мөһим булуын күрсәтте (Carlisle et al., 2020).
Онкогеннарның координацияләнгән транскрипциясе суперэнхансерлар, транскрипция факторлары һәм кофакторлар белән көйләнә (Hnisz et al., 2015). Моннан тыш, транскрипция көйләү өчен CDK7, CDK8, CDK9, CDK12 һәм CDK13 кебек циклинга бәйле киназалар төркеме (CDK) кирәк. Алар арасында CDK7 РНК-полимераза II фосфорлануында катнаша, бу TNBC патогенезында онкоген транскрипциясен башлау һәм киңәйтү өчен бик мөһим. Бер мөһим тикшеренүдә CRISPR/Cas9 тарафыннан CDK7 делециясе TNBCны тоткарлаган, бу TNBC патогенезының CDK7га бәйле булуын күрсәтә (Wang Y. et al., 2015).
Тикшеренүләр күрсәткәнчә, MYC һәм RBP (РНК бәйләүче аксым) мутацияләре апоптозга китерергә мөмкин, ә MYC яки RBPдагы бер ген мутацияләре яман шеш күзәнәкләре үсешенә тәэсир итми (Эйнштейн һ.б., 2021). Кеше геномындагы 1000 нән артык RBP CRISPR/Cas9 нигезендәге китапханә ярдәмендә тикшерелде. Алар арасында 57 RBP MYC дәрәҗәсе югары булган яман шеш күзәнәкләре үсеше өчен бик мөһим дип табылды (Wheeler һ.б., 2020). Моннан тыш, YTHDF2 TNBC күзәнәкләренең үсешен саклап калу өчен мөһим һәм MYC экспрессиясе югары булган яман шеш күзәнәкләрендә югары дәрәҗәдәге транскрипция һәм трансляция вакытында метилланган транскриптлар күләмен киметә. Моннан тыш, YTHDF2 яман шеш күзәнәкләре өчен мөһим түгел, алар TNBC пациентларының яшәү вакытын озайту өчен MYC дәрәҗәләренең югары булуына азрак бәйле (Эйнштейн һ.б., 2021), бу аның TNBCны җиңә алырлык дарулар өчен потенциаль терапевтик максат булырга мөмкинлеген күрсәтә.
Цинк бармак аксымнары (ZNF) кеше геномының якынча 1% тәшкил итә. Тикшеренүләр күрсәткәнчә, ZNF төрле яман шеш авыруларында, мәсәлән, бавыр яман шешендә, күкрәк яман шешендә һәм колоректаль яман шештә күзәнәкләрнең үрчүен көйли ала (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). CRISPR нокауты белән булдырылган китапханәләр күкрәк яман шеше күзәнәкләрендә төрле шеш супрессор геннарын (TSG) тикшерү өчен кулланылган (Shalem et al., 2014). Шул вакыттан бирле CRISPR/Cas9 ZNF319 белән бетерелгән күкрәк яман шеше күзәнәкләренең транскриптомик тикшеренүе ZNF319 күкрәк яман шешенең үрчүен киметүче шеш супрессор гены булуын һәм шуңа күрә төрле потенциаль сигнал механизмнарында һәм башка биологик функцияләрдә катнашуын күрсәтте (Wang L. et al., 2022).
Ферроптоз - тимер булуга бәйле программалаштырылган күзәнәк үлеменең бер төре. Ферроптоз үсешенә липид пероксидлары булуы йогынты ясавы билгеле. Моннан тыш, PKCβII липид пероксидациясенең иртә булуын күрсәтә, һәм липид пероксидациясенең артуы ферроптоз белән бәйле. CRISPR/Cas9 аша киназа ингибиторлары китапханәсен тикшерү PKCβII липид пероксидациясе процессында катнашуын күрсәтте, бу MDA-MB-231 күзәнәкләрендә ферроптоз өчен бик мөһим (Zhang et al., 2022). Шуңа күрә, бу CRISPR/Cas9 тарафыннан PKCβII нокаутының ферроптоз белән бәйле авыруларны дәвалау өчен потенциаль шеш супрессоры гены максаты булырга мөмкин дигән фикерне аңлата (Zhang et al., 2022).
Даруларга чыдамлылык яман шеш авыруларында үлем очракларының якынча 90% ын тәшкил итә дип санала һәм яман шешне дәвалаудагы төп кыенлыкларның берсе булып тора (Bukowski et al., 2020). Нәтиҗәләр күрсәткәнчә, даруларның агып чыгуы, ДНКны төзәтү, апоптоз һәм төрле күзәнәк сигнал юллары белән бәйле җитәрлек сандагы геннар даруларга чыдамлылык белән бәйле (Haider et al., 2020). Алар арасында берничә ген CRISPR/Cas9 кораллары белән максат итеп куелган һәм даруларга чыдамлылыкны киметүдә һәм яман шешкә каршы дәвалауның нәтиҗәлелеген арттыруда өметле нәтиҗәләр күрсәткән (Vaghari-Tabari et al., 2022). Моннан тыш, югары җитештерүчәнлекле CRISPR/Cas9 геннарын нокаутлау скрининг китапханәләре потенциаль даруларга чыдамлылык геннарының функциясен үзгәртүдә катнаша (Shalem et al., 2015). Паклитакселга каршы торучанлык геннарын ачыклау өчен, геном буенча sgRNA китапханәсен тикшерү белән берлектә РНК секвенирлавы кулланылды, бу исә кабатланган TNBC белән авыручыларда даруларга каршы торучанлык белән бәйле булган сигез кандидат генны, шул исәптән гистон деацетилаза 9 (HDAC9) генын ачыклау өчен кулланылды (B һ.б., 2020). Башка бер тикшеренүдә, яман шешкә каршы дарулар белән дәваланган TNBC пациентларының исән калу вакытында дизерин/треонин һәм тирозин протеин киназасы (DSTYK) экспрессиясенең артуы күзәтелде. Моннан тыш, DSTYKның CRISPR/Cas9 аша нокдауны даруларга каршы торучан яман шеш күзәнәкләренең in vitro (SUM102PT күзәнәкләре һәм MDA-MB-468 күзәнәкләре) һәм in vivo TNBC моделенең апоптозын сизелерлек көчәйтте (Ogbu һ.б., 2021).
TNBC MAPK юлының аномаль активлашуына карамастан, MEK-ны максат итеп куйган терапияләрнең клиник эффекты начар. CRISPR/Cas9 геном китапханәсе скринингы PSMG2 (протеом җыелмасы шапероны 2) ингибирлавы TNBC BT549 һәм MB468 күзәнәкләрен MEK ингибиторы AZD6244кә сизгерләндерүен күрсәтте. PSMG2-нең CRISPR/Cas9 нокдауны нормаль протеасома функциясен үзгәртте, бу PDPK1-нең аутофагия аша таркалуына китерде, шуның белән AZD6244 (MEK ингибиторы) һәм MG132 (протеасома ингибиторы) тарафыннан индукцияләнгән TNBC тычкан модельләрендә шеш күзәнәкләрен тагын да яхшыртты. Шулай итеп, протеасома һәм MAP киназа (MEK) ингибиторлары шеш күзәнәкләренең пролиферациясен киметү өчен синергетик рәвештә кулланылырга мөмкин (Wang X. һ.б., 2022).
CRISPR/Cas9 шулай ук TNBCга каршы торучанлыкка китерә торган ген функциясенең югалуын тикшерү өчен кулланылган (Shu et al., 2020). Ge һ.б. TNBCда BET бромодомен ингибиторы (BBDI) JQ1 белән дәваланган яман шеш күзәнәкләренең даруларга каршы тору механизмын аңлаттылар. CRISPR/Cas9 кулланып, алар rb1 генын бетерү TNBCның яман шешкә каршы препарат JQ1га каршы торучан булуын ачыкладылар. Шуңа күрә, rb1 функциясе TNBCда JQ1 препаратларына җавап бирүдә мөһим. Алар шулай ук паклитакселның CDK4/6 киназа/микротүбә ингибиторы булуын, һәм аның JQ1 кебек BBDI белән берләшүенең даруларга каршы торучан TNBCга өметле терапевтик җаваплар бирүен хәбәр иттеләр (Ge һ.б., 2020).
Озын кодланмаган РНКның (lncRNA) транскрипция ландшафтының TNBCда неоадъювант терапиягә каршылык күрсәтүе турында хәбәр ителгән. Бу тикшеренү күрсәткәнчә, биш төрле MALAT1 lncRNA транскрипты TNBCда югары дәрәҗәдә экспрессияләнә. Моннан тыш, MALAT1ның CRISPR/Cas9 аша бетерелүе TNBC BT-549 күзәнәкләренең паклитаксел һәм доксорубицинга сизгерлеген арттырды, бу TNBCда MALAT1га каршылык күрсәтүнең потенциаль ролен күрсәтә (Shaath et al., 2021).
BRCA1 (BRCA1m) мутацияләре гетероген һәм шуңа күрә ачыклау авыр. BRCA1-ның синтетик үлемечле партнеры булган PARP1-гә (поли(ADP-рибоза) полимераза) юнәлтелгәндә, TNBC препаратының хемосенсибилизациясе артырга мөмкин. CRISPR/Cas9 кулланып, PARP1-ны бетерү доксорубицин, гемцитабин һәм доцетаксел кебек яман шешкә каршы препаратларның mBRCA1 мутант TNBC күзәнәкләренә сизгерлеген арттырды, бу PARP1-ның TNBC-да даруларга каршы торучанлыкта да катнашуын күрсәтә (Vaghari-Tabari et al., 2022). Шешне басучы BRCA1 яки BRCA2 геннарындагы мутацияләр кешеләрдә күкрәк яман шеше үсеш ихтималын арттыра дип билгеле. Бу пациентларны дәвалау өчен PARP ингибиторларын куллану кирәк. Моннан тыш, CRISPR/Cas9 кулланып нуклеотидны коткару факторы DNPH1ны нокаутлау токсик нуклеотид 5-гидроксиметилдезоксиуридин (hmdU) монофосфатын бетерә алуы, шуның белән BRCA җитмәгән күзәнәкләрнең PARP ингибиторларына сизгерлегенә җавап бирүен көчәйтүе күрсәтелде (Fugger). һ.б., 2021). Шулай итеп, CRISPR/Cas9 һәм PARP1 ингибиторлары TNBC өчен мөһим дәвалау стратегиясенә әйләнергә мөмкин.
Пенетрант гликопротеин (P-gp) гены - күп даруларга чыдамлылык гены, ул, гадәттә, барлык TNBCларның якынча 41% ында югарырак регуляторлана (Sun et al., 2020). P-gp китереп чыгарган даруларның агып чыгуы күкрәк яман шешендә даруларга чыдамлылыкның төп регуляторы буларак билгеләнде. P-gp ингибиторлары күкрәк яман шешендә яман шешкә каршы даруларга сизгерлекнең артуын күрсәттеләр (Famta et al., 2021). Шулай итеп, CRISPR/Cas9 ярдәмендә P-gp һәм P-gp ингибиторларын абляцияләү яки бастыру TNBCда даруларга чыдамлылыкны җиңү өчен бик мөһим ысуллар булырга мөмкин.
АТФ белән бәйләүче кассета транспортеры G2 (ABCG2) TNBCда даруларга каршы торучанлык китереп чыгаруы билгеле (Palasuberniam et al., 2015), гәрчә хәзерге вакытта CRISPR/Cas9 һәм ABCG2 тындыруы һәм шеш супрессоры генын инактивлаштыру арасындагы бәйләнеш турында бернинди дә хәбәрләр юк. PTEN ABCG2 активациясен көчәйтергә мөмкин (Palasuberniam et al., 2015), (Deepak Singh et al., 2021). Шуңа күрә, ABCG2ны бетерү өчен CRISP/Ca9 куллану һәм аны ABCG2 ингибиторы белән берләштерү TNBCда даруларга каршы торучанлыкны җиңү өчен яраклы дәвалау булырга мөмкин. 2 нче таблицада CRISPR/Cas9 барлык каршылык геннарына да юнәлтелгән дип әйтелә.
2 нче таблица. CRISPR/Cas9 төрле TNBC каршылык геннарын күзәнәкләрне яман шешкә каршы препаратларга сизгерләштерү өчен куллана.
CRISPR/Cas9 китапханәләре яман шеш патогенезы белән бәйле ген мутацияләрен скрининглау өчен потенциаль кораллар булып тора (Chan et al., 2022). Бу скрининг ысулы дүрт этапны үз эченә ала, мәсәлән: (а) китапханә төзү, (б) лентивирус трансдукциясе, (в) фенотипик скрининг һәм (г) максатлы ген анализы. TNBC'да MAPK юлының аномаль активациясе булса да, PTEN, RB1 һәм TP53 кебек шеш супрессор геннарында мутацияләр йөртүче TNBC пациентлары өчен MEK максатлы терапиясенең клиник фаразы бик начар.
Моннан тыш, CRISPR/Cas9 кулланып ген нокаут скринингы Гватемала чәчәкләре һәм яфраклары экстрактларында күп булган иң көчле һәм сайлап алынган молекула - дегидрокатролны сынап карады, ул дегидрокатролның MDA-MB-231гә йогынтысын аңлау өчен. Селектив күзәнәк цитотоксиклыгы механизмнары. TNBC субтипларының мезенхималь сабак үзенчәлекләре. Бу CRISPR/Cas9 нигезендәге скрининг шулай ук 17β-гидроксистероид дегидрогеназа 11 тибын кодлаучы HSD17B11 генының MDA-MB-231 күзәнәкләрендә югары дәрәҗәдә экспрессияләнүен һәм MDA-MB-231 күзәнәкләре өчен специфик дегидрофалькаринол барлыкка килүен күрсәтте (Grant et al., 2020). Шулай итеп, бу CRISPR/Cas9 геном скринингының потенциаль табигый кушылмаларның яман шешкә каршы үзлекләренең нигезендә яткан механизмнарны ачыклауда зур потенциалга ия булуын күрсәтә.
Моннан тыш, TNBC-ның яман шешкә бирешүчәнлеге геном буенча in vivo CRISPR/Cas9 скринингы ярдәмендә өйрәнелде, ул онкоген һәм шешне бастыручы юллар арасындагы бәйләнешне күрсәтте. mTOR һәм Hippo юлларының төп компонентлары TNBC-да шешне көйләүдә мөһим роль уйный дип хәбәр ителә. Моннан тыш, тикшеренүләр күрсәткәнчә, mTORC1/2 һәм YAP онкопротеинын фармакологик ингибирлау in vitro дару-матрица синергия моделен һәм in vivo пациентлардан алынган ксенотрансплантатларны кулланып TNBC-ның патогенлыгын нәтиҗәле рәвештә тоткарлый. Моннан тыш, Торин-1 ярдәмендә mTORC1/2 ингибирлавы макропиноцитозны көчәйтә, ә вертепорфин белән индукцияләнгән YAP ингибирлавы TNBC күзәнәкләренең үлеменә китерә. Бергәләп караганда, бу нәтиҗәләр TNBC өчен яңа һәм нәтиҗәле дәвалау ысулларын билгеләү өчен геном буенча in vivo CRISPR скринингының көчен һәм ныклыгын күрсәтә (Dai et al., 2021).
Иммун системасының регуляциясе бозылу шеш барлыкка килүдә мөһим фактор булып тора. Рак күзәнәкләре саклану механизмнарын урап үтеп, шул исәптән шеш микротирәлегендә иммун күзәнәкләре эшчәнлегенә комачаулап һәм иммун системасына зыян китереп, иммун чистартудан качалар. Шуңа күрә, яхшыртылган иммун системасын үстерү шешләргә каршы көрәшнең төп ысулы булырга мөмкин. CRISPR/Cas9 нигезендәге ген модификациясен куллану иммун дисфункциясенә бәйле берничә мәсьәләне төрле яктан хәл итә. CRISPR/Cas9 күкрәк яман шешенә каршы шешкә каршы иммунитетны түбәндәге юллар аша яхшырту өчен кулланылган (3 нче рәсем).
3 нче рәсем. CRISPR/Cas9 иммунотерапиясе TNBC күзәнәкләренә юнәлтелгән. CDK5 югалту һәм PDL1 һәм CD155 нокдауннары иммун системасын көчәйтә. Шулай ук, A2AR югалту һәм HER2, муцин 1 һәм TEM8 кебек TAA нокдауннары CAR-T күзәнәкләренең яман шеш күзәнәкләрен үтерүдәге нәтиҗәлелеген арттырды. CRISPR/Cas9 ярдәмендә үткәрелгән Т күзәнәк скринингы p38 киназасы бозылуының Т күзәнәкләренең шешкә каршы активлыгын арттыруын күрсәтте. CRISPR/Cas9 тарафыннан үзгәртелгән Т күзәнәкләре TCR (Т күзәнәк рецепторы) экспрессиясен арттыра, нәтиҗәдә Т күзәнәкләрендә шешкә каршы активлык барлыкка килә.
Иммунотерапиянең максаты - иммун системасын яман шеш күзәнәкләренә һөҗүм итәргә стимуллаштыру. Иммун контроль-үткәрү ноктасы аксымнарының артык экспрессиясе гадәттә аутоиммун реакцияләрне булдырмый, ләкин яман шеш авыруларыннан сакланырга ярдәм итә ала (Topalian et al., 2015). Бу аксымнар иммун күзәнәкләре өслегендәге рецепторларга бәйләнү аша иммун реакцияләрен булдырмый. Күп контроль-үткәрү ноктасы аксымнары (мәсәлән, CD155 һәм PD-L1) иммун күзәнәкләрендәге PD-1 рецепторына юнәлтелгән һәм күкрәк яман шешендә, бигрәк тә TNBCда экспрессияләнә (Li Y.-C. et al., 2020). CRISPR/Cas9 кулланып PD-L1 яки аның рецепторын нокаутлау иммун системасын TNBC шешләренә һөҗүм итәргә стимуллаштыра ала (Yahata et al., 2019). Моннан тыш, CRISPR/Cas9 аша CDK5 бетерү аша PD-L1 экспрессиясен киметү in vitro һәм in vivo шартларында шеш үсешен тоткарлый дип күрсәтелгән (Deng et al., 2020). Күкрәк яман шешенең in vitro һәм in vivo модельләрендә үсешне тоткарлау, shRNA ярдәмендә CD155 кимүенең күкрәк яман шешенә терапевтик йогынты ясарга мөмкинлеген күрсәтә (Gao һ.б., 2018).
CAR T күзәнәкләре шеш белән бәйле антигеннарны (TAA) таный торган һәм үз активлыгын арттыру өчен контроль нокта аксымнарын нокдаун куллана ала торган CARларны экспрессияли (Li C. һ.б., 2020). Күкрәк яман шешендә CAR T күзәнәкләре терапиясе өчен төрле потенциаль максатлар бар, шул исәптән HER2, mucin1 һәм TEM8 кебек берничә TAA (Bajgain һ.б., 2018). Мезотелинга юнәлтелгән CAR T күзәнәкләре (TNBC BT-459 күзәнәкләрендә артык экспрессияләнгән) CRISPR/Cas9 ярдәмендә PD-1 нокдаунга эләккәндә яман шешкә каршы нәтиҗәлерәк булуы турында дәлилләр бар (Hu һ.б., 2019). Ләкин, пациентлардан Т күзәнәкләрен аеру һәм аннары аларны ex vivo үзгәртү - күп хезмәт һәм вакыт таләп итә торган процесс. Универсаль Т күзәнәкләре изоляция таләпләрен киметә алса да, кеше лейкоцит антигенын (HLA) I класс һәм Т күзәнәк рецепторын (TCR) экспрессияләүче донор Т күзәнәкләрен трансплантат хуҗага каршы аномалияләрне булдырмас өчен алып ташларга кирәк (Ren һ.б., 2017). , 2017a). CRISPR/Cas9 кулланып, HDR бер үк вакытта TCR һәм HLAны бетерә һәм CARны кодлаучы генны юкка чыгара ала. Тикшеренүләр күрсәткәнчә, CRISPR/Cas9 TCR локусына CD19га каршы CARларны кертү өчен кулланылырга мөмкин, шуның белән Т күзәнәкләрен бетермичә CARларны нәтиҗәле җитештерә (Dimitri et al., 2022). TCR, бета-2-микроглобулин (B2M), HLA-I субберәмлеген һәм PD-1 һәм CTLA-4 кебек башка аксымнарны бер үк вакытта бетерү юлы белән аллоген CAR T күзәнәкләрен булдыру өчен мультиплекс технологияләре эшләнгән, алар TNBCга каршы яман шешкә каршы үзлекләргә ия булырга мөмкин (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022).
CRISPR/Cas9 куллану CAR-T күзәнәкләренең нәтиҗәлелеген арттырырга мөмкин. Аденозинның иммуносупрессив үзлекләргә ия булуы һәм Т күзәнәкләренең функциясен блоклау һәм аденозин A2A рецепторларын (A2AR) активлаштыру юлы белән яман шешкә каршы иммунитетны киметә алуы билгеле (Vigano et al., 2019). CRISPR/Cas9 кулланып A2ARны тындыру in vivo CAR-T күзәнәкләренең нәтиҗәлелеген сизелерлек яхшыртты (Giuffrida et al., 2021). Т күзәнәкләренең күзәнәк киңәюе, дифференциациясе, оксидатив стресс һәм геном стрессы кебек төрле фенотипик үзенчәлекләр күрсәтүе билгеле. CRISPR/Cas9 нигезендәге Т күзәнәк скринингы 25 төрле Т күзәнәк рецептор киназасы бозылуын ачыклады. Алар арасында p38 киназасын бетерү Т күзәнәкләренең шешкә каршы активлыгын көчәйтә, бу p38 киназаның CAR-T күзәнәкләренең регуляциясенең төп регуляторы булуын күрсәтә (Gurusamy et al., 2020).
Т-күзәнәкләрне югары экспрессияләнгән TCRлар җитештерү өчен CRISPR/Cas9 ярдәмендә генетик яктан модификацияләргә мөмкин. Генетик яктан модификацияләнгән Т-күзәнәкләрне пациентларга күчерү эндоген Т-күзәнәкләргә караганда көчлерәк яман шешкә каршы активлык күрсәтте. Шуңа күрә эндоген TCRлар пациентларда генетик яктан үзгәртелгән TCRлар белән көндәшлек итә ала, бу яман шеш иммунотерапиясе потенциалына тәэсир итәргә мөмкин. Бу проблеманы хәл итү өчен, реципиент күзәнәкләрдәге эндоген TCR-βны бетерү һәм аннан соң TCR-β Т-күзәнәкләрен яман шеш белән авыручыларга күчерү өчен CRISPR/Cas9 куллану эндоген TCR җенси көндәшлегенә мохтаҗлык булмыйча, яман шешкә каршы иммун җавапларын яхшырак күрсәтергә мөмкин (Fan et al. 2018). Шулай итеп, CRISPR белән модификацияләнгән Т-күзәнәкләрдән кала, TCRлар гадәти TCR белән трансдукцияләнгән Т-күзәнәкләргә караганда шеш антигеннарына мең тапкыр сизгеррәк. Моннан тыш, төрле лейкемияләрдә γδ TCR+ CRISPR тарафыннан генерацияләнгән үзгәртелгән Т-күзәнәкләре стандарт TCR трансферына караганда CD4+ һәм CD8+ Т-күзәнәкләренең югарырак экспрессиясен күрсәтә (Legut et al., 2018). Шулай итеп, CRISPR/Cas9 тарафыннан генерацияләнгән модификацияләнгән Т-күзәнәкләре TNBCны җиңү өчен нәтиҗәле иммунотерапия ысулы булырга мөмкин.
Интегриннар - күзәнәк трансмембранасында булган һәм күзәнәкләрнең тышкы матрицага (ECM) бәйләнүен стимуллаштырган күзәнәк адгезия молекулалары (Hamidi һәм Ivaska, 2018). Интегриннарның регуляциясе бозылуы, тышкы матрицаны үзгәртү юлы белән, яман шеш үсеше һәм миграциясе белән бәйле, бу кан әйләнешендә яман шеш күзәнәкләренең яшәвенә китерә (Hamidi һәм Ivaska, 2018). CRISPR/Cas9 аша интегринны нокдаунлау TNBCда шеш үсешен, метастазларны һәм колонизацияне әкренәйтә. Интегрин a5 (ITGA5) нокдаунының үпкә яман шеше кебек башка яман шешләрдә күзәнәк миграциясен һәм үсешен киметүе турында хәбәр ителгән (Ju et al., 2017), бу интегрин a5ның TNBC патогенезында төп фактор булырга мөмкинлеген күрсәтә.
Традицион эмбриональ күзәнәк (ES) ысулларын кулланып нокаут тычканнарын булдыру - күп көч таләп итә торган, вакыт таләп итә торган һәм нәтиҗәсез процесс. Гомологик рекомбинация аша ES күзәнәкләрен максат итеп кую, химерик тычканнарны үрчетү, аннары аларны гетерозиготалы тычканнар белән кушып, гомозиготалы токымнар алу өчен айлар һәм еллар кирәк. Күп генетик мутацияле тычканнар булдыру өчен катлаулы кроссбридинг кирәк. Ләкин, CRISPR/Cas9 кулланып ES күзәнәкләрен абляцияләү яки CRISPR/Cas9 компонентларын бер күзәнәкле аталандырылган йомыркаларга микроинъекцияләү юлы белән алынган тычканнарны кулланганда күп кенә проблемалар туа. Мәсәлән, үзгәрешләр еш кына биаллелик локусларда була һәм генга хас түгел. Күптән түгел CRISPR/Cas9 технологиясен кулланып ES күзәнәкләре бер үк вакытта 5 генга кадәр биаллелик мутацияләрне кертә ала дип хәбәр ителде (Nishizono et al., 2021). Бу максатта Cas9 мРНК һәм биш генга хас гРНК бер үк вакытта ES күзәнәкләренә трансфекцияләнде. Бу процедураның өметлелеген һәм нәтиҗәлелеген күрсәтә, гәрчә бу мутацияләр нигез салучы линияләр биш тапкыр нокаут тычканнар алу өчен үрчетелгәндә күчкән булырга мөмкин. Тикшеренү шулай ук гаҗәпләндергеч ачыш турында хәбәр итә: генетик яктан модификацияләнгән тычканнар булдыру өчен ES күзәнәкләре кирәк түгел. Киресенчә, билгеле бер ген продуктларын бетерү өчен, Cas9 мРНК һәм гРНК бер күзәнәкле стадиядәге эмбрионнарга кертелде. Нәтиҗәдә, тычканнарда геннарны бетерү нәтиҗәләрен өйрәнү өчен теоретик яктан кулланылырга мөмкин булган нокаут нигез салучы линияләре булдырылды (Qin et al., 2016). Шулай итеп, CRISPR/Cas9 трансген тычканнарны TNBCны традицион генетик инженериягә караганда арзанрак бәягә дәвалау өчен булдырырга мөмкинлек бирә. CRISPR/Cas системасын кулланып, TNBCда бер яки берничә эндоген генга нокта мутацияләрен уңышлы кертә алырлык яңа нокаут тычкан моделе эшләнде. Бу концепциягә нигезләнеп, TNBC хайван модельләрен CRISPR/Cas9 ярдәмендә BRCA1 һәм p53 бетерү ысулы белән дә эшләп була, бу исә HR ремонтын югалтуга, геном тотрыксызлыгына һәм мутант фенотипларга китерә (Annunziato et al., 2020).
Хәзерге вакытта маммография, магнит-резонанс томографиясе (МРТ) һәм УЗИ кебек төрле ысуллар TNBC диагнозын кую өчен кулланыла. Ләкин бу ысулларның кайбер чикләүләре бар. Маммография яман шеш күзәнәкләре башка органнарга күчкән метастазларны түгел, ә җирле күкрәк тукымаларын диагностикалау өчен кулланыла. УЗИ TNBC диагнозын кую өчен ышанычлы ысул түгел (Chen һәм Lee-Felker, 2023). МРТ УЗИ һәм маммографиягә караганда югарырак сизгерлеккә ия, ләкин аның диагностик төгәллеге чикләнгән (Sha һәм Chen, 2022). Тукымалар биопсиясе яман шеш күзәнәкләрен ачыклауның инвазив ысулы. Ләкин, кайбер очракларда, энә кызыксыну зонасыннан читкә китсә, биопсия яман шеш тукымаларын калдырырга мөмкин. Моннан тыш, ул бик кыйммәт һәм пациент өчен травматик булырга мөмкин. TNBC - гетероген яман шеш төре, шуңа күрә биопсия яман шеш төре турында җитәрлек мәгълүмат бирмәскә мөмкин. Шуңа күрә TNBCны ачыклау өчен яңа диагностик яктан ышанычлы ысул ашыгыч рәвештә кирәк. CRISPR/Cas9 күкрәк яман шешен диагностикалау өчен бик сизгер һәм минималь инвазив альтернатива булып хезмәт итә ала. Моның өчен CRISPR/Cas9 нигезендәге стратегияләр TNBC диагностикасы өчен ПЦР ысулларын яхшырту өчен кулланылырга мөмкин. Башта CRISPR системасының Cas9 һәм cpf1 аксымнары специфик булмаган ДНКны бетерү өчен кулланыла, аннары бу ике аксым (Cas9 һәм cpf1) максатлы ДНКга бәйләнгәнче PAM эзлеклелеген таный ала (Deepak Singh et al., 2021). Шулай итеп, ПЦР яман шеш үсеше белән бәйле мутацияләрне ачыклый ала. Берничә тикшеренү төрле яман шеш авыруларында төрле мутацияләрне ачыклау өчен бу CRISPR нигезендәге стратегияне кабул итте (Safari et al., 2019). Шулай итеп, CRISPR нигезендәге ПЦР ысуллары TNBC диагностикасының биопсиягә нигезләнгән иммуногистохимия кебек инвазив ысулларга бәйлелеген киметергә мөмкин.
Гормон рецепторларын көйләүдә генотипик үзгәрешләр TNBC да күрсәтелгән (Chen һәм Russo, 2009). Дәвалау ноктасында диагностикалау өчен микрочиплар кулланып, CRISPR/Cas9 нигезендәге ПЦР стратегияләре бу мутацияләрне нәтиҗәле күзәтә ала (Hajian et al., 2019). Ул шулай ук сәламәтлек саклау хезмәткәрләренә TNBC пациентларындагы билгеле бер мутацияләр турында тиешле мәгълүмат бирә ала, бу аларның дәвалау курсын яхшыртырга ярдәм итә ала. Ләкин бу берләштерелгән техниканың чикләүләре бар. Шуңа күрә, бу CRISPR/Cas-PCR ысулын сәламәтлек саклауда TNBC диагностикасы өчен куллану алдыннан киң тикшеренү эшләре кирәк (Yang et al., 2019).
Бастырып чыгару вакыты: 2024 елның 14 октябре